李曉蕓， 倪茜茜， 華 靜

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院 消化內(nèi)科， 上海 200001

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外乙醇、藥物等其他明確因素導(dǎo)致的以肝細胞內(nèi)脂肪過量沉積為主要特征的一種代謝應(yīng)激性肝損傷，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)[1]。體內(nèi)外高脂環(huán)境誘導(dǎo)的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過量沉積可誘發(fā)代謝-炎癥反應(yīng)。作為肝內(nèi)天然免疫的關(guān)鍵細胞，巨噬細胞具有高度異質(zhì)性和可塑性，在不同微環(huán)境刺激下可活化為經(jīng)典活化型(M1型)和替代活化型(M2型)，分別發(fā)揮促炎和抗炎作用[2]。既往研究[3]發(fā)現(xiàn)不同脂肪酸誘導(dǎo)的巨噬細胞M1/M2型極化改變能直接影響肝細胞脂質(zhì)代謝。反之，脂肪變性的肝細胞能否對巨噬細胞極化及相關(guān)炎癥通路產(chǎn)生直接影響？因此，本研究建立小鼠原代肝細胞脂肪變性體外模型，通過條件共培養(yǎng)體系探究脂肪變性的肝細胞對巨噬細胞極化的影響，并基于經(jīng)典的炎癥通路Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB蛋白活化情況探討可能的作用機制，為NAFLD的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 10只健康雄性8周齡C57BL/6小鼠購自本院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018 - 0008；實驗動物使用許可證編號：SYXK(滬) 2011-0121。小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 棕櫚酸 (palmitic acid，PA)、油酸(oleic acid，OA)、Ⅰ型和Ⅳ型膠原酶、臺盼藍染料購自美國Sigma公司；D-Hanks液、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；Ⅰ型鼠尾膠原購自上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司；油紅O染料購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；甘油三酯(TG)試劑盒、總膽固醇(T-CHO)試劑盒、游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；IL-6、IL-1β、TNFα ELISA試劑盒購自eBioscience公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自Takara公司；PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司；各兔抗鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司和美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代肝細胞的分離與培養(yǎng) 8周齡正常飲食小鼠予4%水合氯醛0.01 mg/L麻醉后打開胸腹腔，24G穿刺插管下腔靜脈，予D-Hanks液灌注，至肝臟呈土黃色后繼以含0.025%Ⅰ型膠原酶和0.05% Ⅳ型膠原酶的DMEM灌注，至肝組織變軟后取下剪碎置于含膠原酶的溶液中37 ℃水浴消化，100 μm無菌篩網(wǎng)過濾，獲得細胞懸液，并離心獲得肝細胞。臺盼藍染色檢測細胞活率>85%，調(diào)整細胞濃度至2×106個/ml，接種于鋪有 Ⅰ 型鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 h，洗去未貼壁細胞。

1.2.2 體外FFA處理原代肝細胞 原代分離的肝細胞培養(yǎng)6 h后換液，將細胞分為對照(NC)組和混合FFA處理組。PA和OA以1∶2 (PA：0.33 mmol/L，OA：0.66 mmol/L)比例配制終濃度為1 mmol/L的FFA混合液[4]，以含F(xiàn)FA的DMEM+1%BSA培養(yǎng)液孵育肝細胞，正常NC組肝細胞以DMEM+1%BSA培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h和24 h，收集培養(yǎng)24 h后的細胞培養(yǎng)上清液，過濾得到相應(yīng)的條件培養(yǎng)液 (conditioned medium，CM)，分別為CM-FFA、CM-NC。

1.2.3 肝細胞CM孵育巨噬細胞株RAW264.7 RAW264.7細胞株傳代后調(diào)整細胞濃度至1×105個/ml，接種于6孔板。分別以CM-NC和CM-FFA孵育巨噬細胞株RAW264.7，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h和24 h后收集細胞待測。

1.2.4 油紅O染色檢測肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 FFA孵育肝細胞24 h后，去上清液，磷酸鹽緩沖液清洗細胞2次，4%多聚甲醛固定細胞15 min，油紅O避光染色30 min，60%異丙醇沖洗2 s，蒸餾水清洗30 s，蘇木素染色25 s，明膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。

1.2.5 肝細胞內(nèi)脂質(zhì)、上清液中細胞因子水平和殘余脂肪酸濃度的測定 收集肝細胞培養(yǎng)24 h后的細胞蛋白和培養(yǎng)上清，分別用試劑盒檢測肝細胞內(nèi)TG和T-CHO含量，ELISA法檢測肝細胞培養(yǎng)上清細胞因子水平，采用試劑盒測定FFA孵育肝細胞24 h后上清殘余脂肪酸的濃度，具體步驟按試劑盒說明測定。

1.2.6 Real-time PCR檢測基因表達 收集正常NC和FFA孵育6 h后的肝細胞和巨噬細胞，用Trizol法提取細胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別行Real-time PCR檢測肝細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和巨噬細胞M1/M2型基因表達，引物序列見表l。Real-time PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照基因，用2-△△CT法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.7 Western Blot檢測蛋白表達 收集肝細胞CM孵育 24 h后的巨噬細胞，以細胞裂解液(購自中國碧云天公司)抽提細胞總蛋白。取蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，濕法電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2h，分別加入兔抗鼠TLR4抗體(1∶1000)、兔抗鼠NF-κBp65抗體(1∶1000)、兔抗鼠磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)抗體(1∶1000)、兔抗鼠NF-κB抑制因子(IκBα)抗體(1∶1000)、兔抗鼠磷酸化IκBα(p-IκBα)抗體(1∶1000)、兔抗鼠β-actin抗體(1∶5000)，4 ℃孵育過夜；洗膜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔第二抗體(1∶10 000)，室溫孵育l h；洗膜，加入ECL發(fā)光劑顯色，置暗盒X線曝光，常規(guī)顯影、定影。采用Image J對結(jié)果進行灰度定量分析。

表1 Real-time PCR引物序列表

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號：RJ2018-0930，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結(jié)果

2.1 FFA對肝細胞脂質(zhì)沉積的影響 油紅O染色檢測顯示，NC組肝細胞內(nèi)僅見少量脂滴沉積，F(xiàn)FA孵育可誘導(dǎo)肝細胞內(nèi)大量脂滴沉積(圖1)。肝細胞內(nèi)脂質(zhì)含量測定顯示，F(xiàn)FA孵育后肝細胞內(nèi)TG含量和T-CHO含量均顯著增加(P值均<0.05)(表2)。

注：a，NC組；b，F(xiàn)FA組。

2.2 FFA對肝細胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)FA顯著上調(diào)脂質(zhì)合成基因SREBP1C和FASN 的mRNA表達(P值均< 0.05)，并降低脂質(zhì)分解基因ACOX1 和CPT1A mRNA表達(P值均<0.05)(表2)。

表2 兩組肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對表達量的比較

2.3 FFA對肝細胞分泌細胞因子的影響 以脂多糖(LPS)刺激作為誘導(dǎo)肝細胞炎性細胞因子表達的對照，ELISA檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)FA孵育后肝細胞培養(yǎng)上清中炎性細胞因子IL-6、IL-1β和TNFα的水平明顯增加(P值均< 0.01)(表3)。

表3 FFA對肝細胞分泌細胞因子的影響

2.4 FFA誘導(dǎo)的肝細胞CM對巨噬細胞M1/M2型極化基因表達的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，與CM-NC組相比，F(xiàn)FA孵育的CM-FFA顯著增加巨噬細胞M1型基因iNOS2、TNFα和IL-6 mRNA表達(P值均<0.01)，降低M2型基因IL-10 mRNA表達水平(P<0.01)。為了明確肝細胞CM中殘余FFA對巨噬細胞極化的直接影響，本研究測定了培養(yǎng)上清中殘余FFA濃度(0.22 mmol/L)，并設(shè)定以此濃度FFA直接孵育巨噬細胞(低濃度FFA組)。結(jié)果顯示，與CM-NC組相比，低濃度FFA對巨噬細胞M1型及M2型基因的表達均無顯著影響，說明培養(yǎng)上清中殘余FFA對巨噬細胞極化沒有直接影響(表4)。

表4 3組巨噬細胞M1/M2型極化基因相對表達量的比較

2.5 FFA誘導(dǎo)的肝細胞CM對巨噬細胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的影響 Western Blot 檢測結(jié)果顯示，CM-FFA顯著增加巨噬細胞TLR4、p-NF-κBp65和p-IκBα的蛋白表達水平(P值均<0.05)(圖2，表5)。

圖2 Western Blot檢測FFA誘導(dǎo)的肝細胞CM對巨噬細胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的影響

表5 兩組巨噬細胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白相對表達量的比較

3 討論

NAFLD發(fā)病機制較為復(fù)雜，涉及到經(jīng)典的“二次打擊”學(xué)說和目前普遍接受的“多重打擊”學(xué)說[5]。近年認為，脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的肝臟脂質(zhì)過量沉積和天然免疫紊亂相關(guān)的慢性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)是NAFLD發(fā)生進展中的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

FFA不僅是細胞代謝的重要能量來源, 在調(diào)節(jié)糖、脂代謝和胰島素敏感性等方面也發(fā)揮重要作用。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA水平升高不僅導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗，同時也會刺激肝臟分泌TNFα和IL-6等促炎因子，激活NF-κB炎癥通路。PA和OA是體內(nèi)常見的FFA，以PA為代表的長鏈飽和脂肪酸可增加肝細胞脂毒性。Gómez-Lechón等[4]研究表明，以1 mmol/L濃度的FFA(PA∶OA=1∶2)孵育肝細胞24 h為體外建立肝細胞脂肪變性模型的最適條件。因此，本研究以同樣配比及濃度的FFA孵育小鼠原代肝細胞，結(jié)果表明，F(xiàn)FA誘導(dǎo)小鼠原代肝細胞明顯脂質(zhì)沉積，細胞內(nèi)生成TG及T-CHO水平顯著增加，F(xiàn)FA促使肝細胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP1C和FASN的表達顯著上調(diào)，脂質(zhì)分解基因ACOX1和CPT1A的表達顯著下調(diào)。并且，脂肪變性的肝細胞能分泌較高水平的炎性細胞因子(IL-6、IL-1β和TNFα)。這些研究結(jié)果提示，F(xiàn)FA不僅促進了肝臟脂質(zhì)過量沉積和代謝異常，也可直接誘發(fā)肝細胞炎癥反應(yīng)。因此，肝細胞作為體內(nèi)重要的脂質(zhì)代謝異常和炎癥反應(yīng)的樞紐場所，在NAFLD進展中發(fā)揮重要的始動作用。

巨噬細胞，包括肝內(nèi)固有的Kupffer細胞和外周血募集的巨噬細胞，是肝內(nèi)天然免疫的關(guān)鍵細胞，在NAFLD發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7]。清除肝內(nèi)活化的Kupffer細胞則可減輕肝臟脂肪變性、促炎性單核細胞的浸潤和胰島素抵抗[8]。體內(nèi)外高脂環(huán)境下巨噬細胞/Kupffer細胞與肝細胞間存在密切相互作用，兩者間“對話”對NAFLD的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。筆者的既往研究[3,9]也發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的M1型巨噬細胞極化可促進肝細胞脂質(zhì)合成，肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積是NAFLD最為顯著的特征[10]，盡管脂肪變性的肝細胞具有一定的炎癥反應(yīng)性，但目前鮮少有研究關(guān)注脂肪變性的肝細胞對巨噬細胞極化的影響。在本研究中，筆者通過建立脂肪變性的肝細胞CM與巨噬細胞的共培養(yǎng)體系，探索脂毒性肝細胞對巨噬細胞極化的影響和可能的作用機制。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的脂肪變性的肝細胞培養(yǎng)上清可顯著上調(diào)巨噬細胞M1型基因表達，抑制部分M2型基因表達，促進巨噬細胞M1型活化。為了排除FFA孵育肝細胞的CM中殘余脂肪酸對巨噬細胞極化的直接影響，本研究測定了培養(yǎng)上清中的殘余FFA濃度，發(fā)現(xiàn)FFA孵育肝細胞24 h后上清中殘余FFA濃度較低，僅0.22 mmol/L，此低濃度的FFA對巨噬細胞的極化沒有顯著的直接影響。本研究結(jié)果提示脂肪變性的肝細胞能通過分泌炎癥因子調(diào)節(jié)巨噬細胞極性改變。

TLR4作為TLRs最重要的亞型之一，可特異性識別細菌LPS，參與調(diào)節(jié)機體免疫功能、細胞凋亡、炎性反應(yīng)等過程[11-12]。激活的TLR4經(jīng)過構(gòu)象改變和二聚體化，招募MyD88等配體，隨后激活下游的NF-κBp65。NF-κB是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的核因子，當 NF-κB的作用受到抑制時，巨噬細胞可從M1型向M2型轉(zhuǎn)化[13]。本研究表明，脂肪變性的肝細胞可顯著增加巨噬細胞TLR4、p-IκBα和p-NF-κBp65的蛋白表達水平，這說明脂毒性肝細胞可直接促進巨噬細胞TLR4/NF-κB炎癥信號通路的活化。因此，可以推測，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的脂肪變性肝細胞可能通過分泌多種促炎性細胞因子，作為損傷相關(guān)分子模式與巨噬細胞膜表面TLR4受體相結(jié)合，招募下游相應(yīng)配體，促使IκB磷酸化，進一步激活NF-κBp65磷酸化，產(chǎn)生炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化改變。

綜上所述，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性通過分泌炎性細胞因子、激活巨噬細胞TLR4/NF-κB炎癥通路，促進巨噬細胞向M1型極化，從而推動NAFLD的發(fā)展。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：李曉蕓、華靜負責(zé)課題設(shè)計，撰寫論文；倪茜茜參與收集數(shù)據(jù)，資料分析；華靜負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。