金繼華，李專，楊欣，尹艾薈，楊玲燕，劉嬌

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

中藥及復(fù)方的多成分導(dǎo)致其分子機(jī)制復(fù)雜，但是中藥及復(fù)方在疾病中的應(yīng)用廣泛，所以需要引進(jìn)新技術(shù)解決中藥成分的復(fù)雜性[1]。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在系統(tǒng)生物學(xué)的基礎(chǔ)上快速發(fā)展起來。從靶點、通路和疾病篩選等多方面揭示中藥及復(fù)方治病機(jī)理[2-3]，也減少了實驗的工作量及科研經(jīng)費，同時為動物實驗及細(xì)胞實驗提供數(shù)據(jù)參考。

天麻(GastrodiaelataBl.)為名貴中藥材，臨床應(yīng)用廣泛，分布我國云南、貴州、四川及陜西等地。具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗驚厥和抗衰老等藥理作用[4]。目前，天麻化學(xué)成分的研究逐漸清晰，主要有酚類、有機(jī)酸類、含氮類、糖類及揮發(fā)性成分[5]，但是天麻揮發(fā)性成分藥理作用的研究報道較少。因此，本研究采用Swiss Target Prediction對天麻揮發(fā)性成分進(jìn)行篩選，采用R軟件對靶點進(jìn)行GO和通路分析。通過Cytoscape3.5.1中的cytoHubba輸出Hub基因。

1 實驗材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

Cytoscape3.5.1(http：//www.cytoscape.org)；STRING(https://string-db.org/)；R(https://www.r-project.org)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)。

1.2 天麻主要揮發(fā)性化學(xué)成分靶點篩選

通過文獻(xiàn)查找，對天麻揮發(fā)性成分相對含量大于5%進(jìn)行統(tǒng)計[6-7]。天麻主要揮發(fā)性成分的靶點篩選基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行篩選，種屬設(shè)置為“人源”，其他參數(shù)默認(rèn)，預(yù)測小分子的靶點[8]。

1.3 GO富集分析

差異基因的基因本體論(Gene Ontology,GO)分為生物過程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和細(xì)胞組成(Cellular Component)三個部分。使用R中clusterProfiler包進(jìn)行GO富集分析。clusterProfiler支持3個物種(人類、小鼠和酵母)，本研究選擇人源，根據(jù)差異基因的ID號進(jìn)行分析[9]。

1.4 通路分析

使用R軟件(ggplot2、clusterProfiler、enrichplot等)明確靶點參與的代謝通路名稱。設(shè)定種為人源，選擇P-value<0.01為閾值。同時使用R語言ggplot2包繪制通路氣泡圖，可以直觀的展示P-value、pathway和count之間的關(guān)系[10]。

1.5 核心靶點分析

Hub基因是具有代表性的一些基因，通過Cytoscape軟件中的CytoHubba模塊識別hub靶點。其提供11中拓?fù)浞治龇椒ǎ狙芯炕谶B接度(Degree)、最大鄰居組件(Maximum neighborhood component，MNC)、應(yīng)力(Stress)、邊過濾成分(Edge Percolated component，EPC)四種算法輸出Hub基因[11-13]。

2 結(jié)果

2.1 天麻揮發(fā)性成分及靶點篩選

通過文獻(xiàn)共篩選出十六酸、亞麻酸、反式角鯊烯、甲氧基乙酸酐、3-糠醛和5-甲基呋喃醛為天麻主要揮發(fā)性成分,見表1。通過Swiss Target Prediction共篩選出242個潛在靶點。

表1 天麻主要揮發(fā)性成分(相對含量>5%)

2.2 靶點GO分析

2.2.1 潛在靶點生物過程分析

對242個靶點進(jìn)行生物過程分析見表2。圖1為242個差異基因的生物過程前10項(P-value<0.01)，在生物過程中，242個靶點主要參與類固醇激素反應(yīng)、類固醇代謝過程、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞對類固醇激素刺激的反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)等。

注：GeneRatio：差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與整個該Term的總基因數(shù)的比值；P-value:富集分析統(tǒng)計學(xué)顯著水平，設(shè)置P-value<0.01；P.adjust：矯正后的P-value。圖1 潛在靶點生物過程分析

表2 潛在靶點生物過程分析

2.2.2 潛在靶點細(xì)胞成分分析

對242個靶點細(xì)胞成分分析見表3。圖2為242個差異基因細(xì)胞成分分析的前10項(P-value<0.01)，在生物過程中，242個靶點主要存在突觸后膜、突觸膜和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等。

注：GeneRatio：差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與整個該Term的總基因數(shù)的比值；P-value:富集分析統(tǒng)計學(xué)顯著水平，設(shè)置P-value<0.01； P.adjust：矯正后的P-value。圖2 潛在靶點細(xì)胞成分分析

表3 潛在靶點細(xì)胞成分分析

2.2.3 靶點分子功能分析

對242個靶點進(jìn)行分子功能分析見表4。圖3為242個差異基因分子功能的前10項(P-value<0.01)。在生物過程中，242個靶點主要參與類固醇激素受體活性、核受體的活動、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能。

表4 靶點分子功能分析

2.3 靶點通路分析

對242個靶點進(jìn)行通路分析見表5。圖3為242個差異基因的生物過程前10項(P-value<0.01)。在通路分析中，242個靶點主要參與花生四烯酸代謝、鈣信號通路、炎癥介導(dǎo)的TRP通道的調(diào)節(jié)和PPAR信號通路等。

表5 潛在靶點通路分析

注：GeneRatio：差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與整個該Term的總基因數(shù)的比值；P-value: 富集分析統(tǒng)計學(xué)顯著水平，設(shè)置P-value<0.01; P.adjust：矯正后的P-value。圖3 靶點分子功能分析

2.4 Hub靶點分析

通過 Cytoscape3.5.1中的CytoHubba中的Stress、Degree、MCC和MNC四種算法輸出前15個Hub基因,見表6;通過取交集的方法獲取11個Hub靶點(IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、PTGS2、CNR1、PPARG、PIK3CA、ESR1、GRM5和MAPK14),詳見圖5。

表6 Hub靶點篩選

注：GeneRatio：差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與整個該Term的總基因數(shù)的比值；P-value:富集分析統(tǒng)計學(xué)顯著水平，設(shè)置P-value<0.01；P.adjust：矯正后的P-value。圖4 靶點通路分析

圖5 Hub靶點篩選

2.5 Hub靶點疾病分析

通過DAVID對11個Hub靶點進(jìn)行疾病分析(P-value)，發(fā)現(xiàn)11個Hub靶點主要在腫瘤(食道癌、結(jié)直腸癌、上皮性卵巢癌、乳腺癌)、2型糖尿病和精神分裂癥等疾病中發(fā)揮作用,見表7。

表7 關(guān)鍵靶點疾病分析

3 討論

天麻是名貴中藥材，藥理作用廣泛，主要涉及到心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，具有增強(qiáng)免疫力、抗炎等多方面作用[14]。目前，對天麻物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究，使其化學(xué)成分越來越清晰。但是其化學(xué)成分藥理作用的相關(guān)靶點尚不明確，如果采用實驗驗證要耗費大量的時間、經(jīng)費等,需要引入新的方法對其活性成分進(jìn)行深入研究，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析對天麻主要揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點篩選、通路分析、GO富集分析，最后篩選11個Hub靶點(IL6、MAPK3、MAPK1、EGFR、PTGS2、CNR1、PPARG、PIK3CA、ESR1、GRM5和MAPK14)。主要在腫瘤(食道癌、結(jié)直腸癌、上皮性卵巢癌)和精神分裂癥、2型糖尿病等疾病中發(fā)揮作用。已經(jīng)有研究表明，天麻在改善學(xué)習(xí)記憶、抗抑郁等神經(jīng)、精神藥理方面均顯示良好的作用。天麻能對神經(jīng)方面的基本具有一定的療效，如改善睡眠質(zhì)量、腦供血不足等[15-16]；同時現(xiàn)代藥理實驗已證明，天麻多糖、天麻復(fù)方(半夏白術(shù)天麻湯)在抗腫瘤、糖尿病中也發(fā)揮重要[17]。

綜上所述,已經(jīng)有研究表明天麻在精神疾病、糖尿病和腫瘤中發(fā)揮作用，但是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未在天麻揮發(fā)性成分中報道，所以本研究初步明確天麻主要揮發(fā)性成分可能在腫瘤、精神疾病、糖尿病中發(fā)揮作用，還需要體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證分析。