焦淑凡，徐龍妹，華征宇，姚菊芳

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海 200127）

本課題組在Wistar 大鼠長(zhǎng)期的繁育過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)與同齡、同性別個(gè)體相比體型顯著矮小的大鼠，經(jīng)“全同胞兄妹交配”培育成近交品系，并將其命名為SDWR，即自發(fā)性侏儒癥Wistar 大鼠（spontaneous dwarfism Wistar rat）[1]。至2020年9 月，SDWR 大鼠已穩(wěn)定連續(xù)近交達(dá)34 代。在針對(duì)SDWR大鼠的長(zhǎng)期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與Wistar大鼠相比，侏儒癥大鼠產(chǎn)仔數(shù)、窩重和離乳率均明顯降低，并伴隨一定比例的不育現(xiàn)象，說(shuō)明SDWR 存在生育下降的問(wèn)題。近年來(lái)，不孕不育患者呈逐漸上升的趨勢(shì)，成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，其治療也是生殖醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。卵巢功能衰退是臨床常見(jiàn)導(dǎo)致生育能力下降的原因之一，其病因復(fù)雜，與遺傳、感染、代謝、免疫、環(huán)境、手術(shù)、藥物和心理等多種因素有關(guān)[2-3]。筆者推測(cè)SDWR繁殖率低下可能與卵巢功能有密切關(guān)聯(lián)。本文通過(guò)探索SDWR 大鼠低繁殖率的原因，期望對(duì)人類(lèi)生育力低及不孕不育的研究和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SDWR大鼠選自本課題組培育第30代的侏儒癥大鼠（SDWR 組）。正常封閉群Wistar 大鼠（作為對(duì)照組）購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2017-0005]。所有大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院屏障設(shè)施+IVC[SYXK（滬）2016-0009]。

1.2 藥物、試劑與儀器

孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）（寧波第二激素廠），批號(hào)S18080，1 000 U 凍干粉；人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠），批號(hào)171113，2 000 U 凍干粉；M2 培養(yǎng)液和透明質(zhì)酸酶（美國(guó)Sigma公司）；HE 染色試劑盒（北京索寶生物科技有限公司）。石蠟包埋機(jī)（EG1150）、石蠟切片機(jī)（RM2235）、體視顯微鏡（DMi8）和正置生物顯微鏡（DM2500）均購(gòu)自德國(guó)Leica 公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 繁殖性能的比較

選擇12 周齡SDWR 及Wistar 雌鼠、雄鼠各5 0 只進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)。按1 ♀∶1 ♂長(zhǎng)期同居，確定妊娠時(shí)將雌性孕鼠分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)SDWR 及Wistar 大鼠1～4 胎繁殖情況。通過(guò)妊娠率、產(chǎn)仔率、初生窩重、離乳重、離乳率比較分析二者繁殖性能。

1.3.2 性成熟期及動(dòng)情期觀察

選擇SDWR及Wistar雌鼠各20只，其中SDWR大鼠8 周齡（繁育過(guò)程觀察其性成熟在12 周左右），Wistar 大鼠5 周齡（性成熟在6～8 周左右），用于性成熟期及動(dòng)情周期的觀察。在每日8∶00、20∶00，分別做陰道脫落細(xì)胞涂片，根據(jù)涂片中的細(xì)胞形態(tài)，判斷大鼠所處的性周期階段，連續(xù)觀察出現(xiàn)2 個(gè)完整的動(dòng)情周期。正常雌性大鼠的動(dòng)情周期為4～5 d，分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期。當(dāng)?shù)谝淮纬霈F(xiàn)完整的動(dòng)情周期，并觀察到外陰口變大且伴隨紅腫、濕潤(rùn)時(shí)，可判定為性成熟。陰道脫落細(xì)胞涂片方法：用生理鹽水（0.9%NaCl 溶液）濕潤(rùn)的棉簽置入陰道內(nèi)1 cm，輕柔旋轉(zhuǎn)1 圈，取出準(zhǔn)備好生理鹽水的載玻片，將棉簽上脫落細(xì)胞均勻地涂抹于載玻片，75%乙醇溶液固定，HE 染色，蓋玻片封固，光學(xué)顯微鏡下觀察動(dòng)情周期[4]。

1.3.3 超排卵效果觀察

選擇6～8周齡SDWR及Wistar雌鼠各20只。實(shí)驗(yàn)前分別用PBS 將PMSG 和hCG 稀釋至200 U/mL，分別用200 U/kg、300 U/kg、400 U/kg劑量的PMSG+hCG 進(jìn)行腹腔注射（超排卵組）。PMSG 注射48 h 后注射hCG，hCG 注射后24 h，用3.5%水合氯醛1 mL/100g 腹腔注射麻醉大鼠。酒精棉球消毒腹部，打開(kāi)腹腔找到輸卵管，用眼科剪將輸卵管取出，置于含M2 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。于正置顯微鏡下找到輸卵管膨大部位，用顯微鑷子將膨大部撕開(kāi)，這時(shí)卵母細(xì)胞團(tuán)會(huì)自動(dòng)滑出。用口吸管將卵母細(xì)胞團(tuán)移至透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)皿中進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞團(tuán)表面顆粒細(xì)胞消化情況。當(dāng)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞發(fā)生分離時(shí)，即刻用口吸管將卵母細(xì)胞移至新鮮M2 培養(yǎng)液中輕柔沖洗6 遍。收集卵母細(xì)胞至新鮮M2 培養(yǎng)液中，顯微鏡下計(jì)數(shù)卵母細(xì)胞數(shù)量，比較SDWR 與Wistar 大鼠的促排卵效果。

1.3.4 卵巢組織形態(tài)觀察

選擇6～8 周齡雌鼠，對(duì)照組、SDWR 組及SDWR 超排卵組（300 U/kg，PMSG+hCG）各20只，將各組大鼠卵巢組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定24 h 后，進(jìn)行脫水，透明，石蠟包埋，切片（5μm）。然后將切片放入60 ℃烘箱中烤3 h，脫蠟水化，流水沖洗1 min，蘇木精染色10 min，流水沖洗1 min，伊紅染色約1 min，乙醇溶液梯度脫水，中性樹(shù)脂封固，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 繁殖性能比較

結(jié)果顯示，1～4 胎SDWR 組妊娠率、產(chǎn)仔數(shù)量、初生窩重、離乳重及離乳率均顯著低于對(duì)照組Wistar 大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表 1 SDWR 與Wistar 大鼠繁殖情況比較Table 1 Comparison of reproductive performance between SDWR and Wistar rats

2.2 性成熟期及動(dòng)情周期比較

陰道脫落細(xì)胞涂片觀察動(dòng)情周期結(jié)果顯示，SDWR 和Wistar 大鼠均出現(xiàn)完整的動(dòng)情周期，對(duì)照組Wistar 大鼠出現(xiàn)完整動(dòng)情周期在（8.05±0.76）周齡，而SDWR 大鼠在（12.15±0.81）周齡，說(shuō)明SDWR 大鼠性成熟時(shí)間與Wistar 大鼠相比明顯推遲（P＜0.01）。

涂片觀察可見(jiàn)，動(dòng)情前期以膨大有核上皮細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量白細(xì)胞及無(wú)核角化上皮細(xì)胞（圖1A）；動(dòng)情期以大量的無(wú)核角化上皮細(xì)胞為主，可聚集成堆（圖1 B）；動(dòng)情后期白細(xì)胞、無(wú)核角化上皮細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞均可見(jiàn)（圖1C）；動(dòng)情間期細(xì)胞總數(shù)較少，以白細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量角化上皮細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞（圖1D）。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組Wistar 大鼠一個(gè)規(guī)律的動(dòng)情周期需要4～5 d；而SDWR 大鼠一個(gè)動(dòng)情周期約7～8 d，且動(dòng)情期縮短，動(dòng)情間期延長(zhǎng)，提示SDWR 組大鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng)和紊亂。

圖 1 陰道脫落細(xì)胞涂片染色結(jié)果（A～D）和各組卵巢組織學(xué)觀察（H～E）Figure 1 The results of Gram staining of the rat vaginal smears (A-D) and morphological observation of the ovarian tissue in each group（H-E）

2.3 超排卵效果比較

超排卵結(jié)果顯示，200 U/kg 、300 U/kg、400 U/kg 的PMSG+hCG 在SDWR 大鼠中均獲得極低的超排效果。200 U/kg 、300 U/kg 和400 U/kg PMSG+hCG 注射后SDWR 大鼠平均排卵數(shù)量分別為（1.0 ±1.4）個(gè)、（1.2 ±1.6 2）個(gè)和（1.6 ±1.5）個(gè)，顯著低于對(duì)照組Wistar 大鼠的（4 2.8 ± 5.0）個(gè)、（4 2.2 ± 4.5）個(gè)和（4 0.4 ±4.7）個(gè)。

2.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組Wistar 大鼠可見(jiàn)生長(zhǎng)活躍的各級(jí)卵泡，顆粒細(xì)胞層排列整齊，黃體數(shù)量多，發(fā)育良好（圖1E）；SDWR 組大鼠卵巢中未見(jiàn)初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡，竇狀卵泡黃體數(shù)量較對(duì)照組Wistar 大鼠明顯減少，卵巢皮質(zhì)發(fā)生纖維化，并且顆粒細(xì)胞排列紊亂，提示其可能存在顆粒細(xì)胞功能受損，從而導(dǎo)致卵子發(fā)育障礙（圖1 F、1G）。采用300 U/kg 的PMSG+hCG 注射SDWR大鼠后，SDWR 超排卵組大鼠卵巢內(nèi)的各級(jí)生長(zhǎng)卵泡沒(méi)有明顯增加（圖1H），黃體數(shù)量較對(duì)照組Wistar 大鼠仍減少，提示SDWR 大鼠對(duì)PMSG+hCG 可能不敏感。

3 討論

本課題在長(zhǎng)期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，SDWR 大鼠繁殖力低下，為探索其原因展開(kāi)了本研究。通過(guò)分析SDWR 和Wistar 大鼠繁殖性能發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠1～4胎平均窩產(chǎn)仔數(shù)12～14只，離乳重45～50 g，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]；而SDWR 大鼠第1～4 胎的妊娠率、窩產(chǎn)仔數(shù)量、初生窩重、離乳重及離乳率均顯著低于Wistar 大鼠，說(shuō)明雌性SDWR 大鼠繁殖性能比Wistar 大鼠低下。動(dòng)情周期檢測(cè)結(jié)果顯示，S D W R 大鼠性成熟周齡比Wistar 大鼠明顯推遲，出現(xiàn)動(dòng)情周期延長(zhǎng)及紊亂。大鼠的動(dòng)情周期可以間接反映卵巢功能[6]。因此，本研究結(jié)果提示SDWR 大鼠卵巢功能可能發(fā)生改變。

排卵數(shù)量是影響生育力的重要因素。有研究表明，約27%的不孕癥由排卵障礙引起[7]。通過(guò)200 U/kg、300 U/kg、400 U/kg PMSG +hCG 超排卵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 種劑量促排卵效果無(wú)明顯差異，結(jié)果顯示6～8周齡對(duì)照組Wistar大鼠獲得良好超排卵效果，而SDWR大鼠極難獲取數(shù)目較多的卵母細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，作者也曾選取不同廠家的PMSG（舒生，批號(hào)180716，1000 IU）和hCG（艾力生，批號(hào)B190303）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到同樣的超排結(jié)果。臨床超排卵不敏感的現(xiàn)象稱(chēng)為卵巢低反應(yīng)（poor ovarian response，POR）[8]。SDWR 大鼠繁殖性能測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，SDWR 大鼠可以自然進(jìn)行繁育，未取得良好超排效果可能與激素劑量、用藥時(shí)間、SDWR 大鼠的動(dòng)情周期等多因素有關(guān)，有待后續(xù)進(jìn)一步探討。

目前，人類(lèi)卵巢早衰發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，病因不明，該病可能是導(dǎo)致生育功能減退及不孕不育的重要原因[9-10]。為了解SDWR 大鼠卵巢功能對(duì)繁殖率的影響，本研究對(duì)SDWR 大鼠卵巢組織進(jìn)行病理切片染色，觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)及各級(jí)卵泡發(fā)育狀態(tài)，結(jié)果顯示，SDWR 大鼠竇狀及各級(jí)卵泡極少見(jiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)卵巢皮質(zhì)纖維化，呈現(xiàn)卵巢早衰表現(xiàn)，提示SDWR 大鼠卵巢功能損傷及卵巢低反應(yīng)可能是導(dǎo)致繁殖率低下的原因之一。常見(jiàn)卵巢早衰模型有放化療藥物造模法、免疫損傷造模法、半乳糖代謝造模法、基因敲除造模法等[11-12]，不同的造模方法根據(jù)其獨(dú)特性適用于不同的實(shí)驗(yàn)研究，具有一定局限性。本研究發(fā)現(xiàn)SDWR 大鼠自身存在卵巢功能低下現(xiàn)象，因此有可能通過(guò)SDWR 大鼠建立一個(gè)適用于多種病因研究的天然卵巢早衰模型。

不孕不育已逐漸成為我國(guó)已婚人群的重要疾病之一，約7%～15%的育齡夫妻受其困擾[13]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，不孕不育可能會(huì)成為人類(lèi)繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大頑疾。輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART），是治療不孕不育的主要手段。盡管ART在治療不孕不育取得顯著進(jìn)展，但是POR 始終是其面臨的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)[14-15]。ART 在體外受精的超控制性促排卵過(guò)程中大約有9%～24%的患者發(fā)生POR[16]，尤其在≥40 歲的高齡女性中發(fā)生率超過(guò)50%[17]，而POR 具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前臨床上常用激素替代療法治療卵巢早衰，但可能會(huì)引起乳腺癌、心臟病和中風(fēng)等嚴(yán)重不良反應(yīng)[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)可能具有臨床研究意義，培育的侏儒癥大鼠有望作為研究卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)的天然模型，為改善卵巢功能及提高生育力研究和治療提供理論依據(jù)。

最近研究揭示，微RNA 與卵巢基因表達(dá)[19]、顆粒細(xì)胞的發(fā)育、卵泡刺激素的分泌有關(guān)[20]。miR-27b、miR-190、miR-151、miR-672、miR-29a和miR-144 表達(dá)[21]、BNC1 基因缺失[22]、COMT基因rs4680位點(diǎn)A等位基因及CpG-8和CpG-10甲基化水平升高都與POF 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。微RNA 表達(dá)、基因缺失和甲基化是否在SDWR大鼠卵巢功能減退中起到重要調(diào)節(jié)作用，有待進(jìn)一步研究。

致謝：本課題實(shí)施和完成階段得到了上海市計(jì)劃生育研究所黃先亮醫(yī)生、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院生殖中心厲心愉醫(yī)生的支持，謹(jǐn)致謝意。