陳國(guó)元，康 康，李曉嫻，紀(jì)文韜，張金梅，馮延花，田倩瑩，吳寶金

（中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，上海 200031）

屏障設(shè)施作為SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主要場(chǎng)地，其日常運(yùn)行的有效管理十分重要。屏障設(shè)施管理除了控制溫度、濕度、光照及噪音等環(huán)境條件，最重要的目標(biāo)就是將病原微生物和寄生蟲(chóng)等威脅動(dòng)物健康的致病因子屏蔽在外[1]。屏障設(shè)施除了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行控制外，還必須考慮其他因素對(duì)屏障內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的影響，其中威脅最大的是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的各種各樣的實(shí)驗(yàn)材料，尤其是那些在屏障外制備的、不允許經(jīng)高壓滅菌的生物活性物質(zhì)和試劑。

自2013 年中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所（現(xiàn)分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心）的2 400 m2動(dòng)物屏障設(shè)施啟用至今，設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)小鼠始終保持SPF 級(jí)。在實(shí)際工作中，本單位重視對(duì)帶入設(shè)施內(nèi)實(shí)驗(yàn)材料的管理，進(jìn)行了連續(xù)5 年的大規(guī)模檢控工作，共檢測(cè)了一萬(wàn)多份實(shí)驗(yàn)材料樣品。現(xiàn)將本單位實(shí)驗(yàn)材料檢控的措施和結(jié)果整理成文，以期對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施的有效管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品的獲取

本研究涉及的檢測(cè)樣品僅為2015—2019 年實(shí)驗(yàn)人員帶入本單位屏障設(shè)施的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料。根據(jù)本單位對(duì)屏障設(shè)施管理的規(guī)章制度要求，每一位實(shí)驗(yàn)人員在完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后將實(shí)驗(yàn)試劑或材料留樣送檢，溶液類樣品體積要求盡量超過(guò)100 μL。針對(duì)溶液類樣品和特殊飼料等非細(xì)胞類樣品，檢測(cè)其是否含帶細(xì)菌；針對(duì)細(xì)胞類樣品，則檢測(cè)其有無(wú)支原體。

1.2 菌落檢測(cè)方法

吸取100 μL 溶液類樣品，涂布于直徑9 cm無(wú)抗L B 平皿（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司）；送樣體積少于100 μL 時(shí)，使用無(wú)菌水補(bǔ)充體積至略超過(guò)100 μL，然后吸取100 μL 涂布于無(wú)抗LB 平皿。特殊飼料等固體樣品，則取小塊樣品無(wú)菌操作搗碎后，使用200 μL 無(wú)菌水浸泡，室溫稍微靜置，再吸取100 μL 上清液涂布于無(wú)抗平皿。平皿在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 以上，檢查有無(wú)菌落和菌落數(shù)量等。

1.3 支原體檢測(cè)方法

吸取細(xì)胞類樣品培養(yǎng)液上清1 000 μL，置于1.5 mL 的EP 管中，不足體積則用無(wú)菌水補(bǔ)足至1 000 μL。100 ℃加熱EP 管10 min，然后以12 000 r/min 離心10 min。只移取上清液100 μL至新的EP 管，該上清液作為后續(xù)PCR 檢測(cè)的樣品。上清液樣品于－20 ℃可保存1 周，于4 ℃只可保存1 d。

使用PCR 法檢測(cè)上清液樣品。PCR反應(yīng)體系（共20μL）：2μL 待檢測(cè)上清樣品，10μL 2×EX Taq mix，0.5 μL 正向引物（序列：5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'），0.5 μL 反向引物（序列：5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'），7 μL 無(wú)菌去離子水。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，37 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物使用含EB 的2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為10 μL/孔。使用上海天能公司生產(chǎn)的Tanon 凝膠成像儀對(duì)電泳膠拍照記錄，支原體陽(yáng)性條帶在270 bp 附近。

1.4 細(xì)菌鑒定方法

對(duì)非細(xì)胞類實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，如果涂布的LB 平皿出現(xiàn)陽(yáng)性菌落，則從平皿中隨機(jī)挑取菌落，用三線法劃線接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂LB平板上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。再?gòu)脑撈矫筇羧慰寺【?，利用試劑盒（康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，正向引物序列為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物序列為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物序列位于細(xì)菌16S 核糖體RNA對(duì)應(yīng)的DNA 編碼區(qū)內(nèi)。P C R 反應(yīng)體系（共20μL）：2μL 樣品，10 μL 2×EX Taq mix，0.5 μL 正向引物，0.5 μL 反向引物，7 μL 無(wú)菌去離子水。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 8 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后確定細(xì)菌種類。BLAST 使用的網(wǎng)站地址為https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

2 結(jié)果

2.1 樣品收集情況

從2015 年開(kāi)始，根據(jù)制定的設(shè)施管理規(guī)定，要求實(shí)驗(yàn)人員將帶入的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行分樣送檢。在操作過(guò)程中，通過(guò)表格登記、傳遞倉(cāng)監(jiān)控、定期回溯有無(wú)人員漏送樣品并加以提醒等措施，促使研究人員如實(shí)送檢樣品。送檢的樣品種類主要有化學(xué)和生物學(xué)試劑、麻醉劑、特殊飼料、細(xì)胞系、質(zhì)粒、DNA 或RNA 等。5 年累計(jì)收檢樣品14 708 份，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室對(duì)所有樣品進(jìn)行了檢測(cè)。表1 為2015—2019 年各種實(shí)驗(yàn)材料數(shù)量（包括非細(xì)胞類樣品材料和細(xì)胞類樣品材料）、收檢樣品分類和總量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從表1 可以看出，隨著屏障內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)量的逐年增加，實(shí)驗(yàn)人員按照要求送檢的樣品總量也逐年遞增。

表 1 2015—2019 年收檢樣品分類和總量統(tǒng)計(jì)表Table 1 Classification and statistics for samples inspected from 2015 to 2019

2.2 非細(xì)胞類樣品菌落檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，約1/3 的樣品無(wú)菌落生長(zhǎng)，多數(shù)送檢樣品有一定量菌落生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)初期的比較權(quán)衡，將單個(gè)平皿菌落總數(shù)30 個(gè)作為控制標(biāo)準(zhǔn)，超過(guò)30 個(gè)菌落的樣品判為細(xì)菌檢測(cè)不合格，并通知實(shí)驗(yàn)人員處理所涉實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物。從表2 列出的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看到，2015 年剛開(kāi)始實(shí)施實(shí)驗(yàn)材料檢控時(shí)，非細(xì)胞類樣品細(xì)菌檢測(cè)陽(yáng)性率比較高。細(xì)菌陽(yáng)性的樣品數(shù)量和陽(yáng)性率呈逐年下降趨勢(shì)，近年來(lái)處在低于1%的檢出率水平。圖1 中的LB 平皿為典型的樣品細(xì)菌檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性的結(jié)果，據(jù)送樣的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)人員反饋，該試劑沒(méi)有經(jīng)過(guò)除菌處理。

圖 1 LB平皿培養(yǎng)結(jié)果Figure 1 Results of a sample cultured on LB plate

表 2 非細(xì)胞類樣品細(xì)菌檢測(cè)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics for bacterial detection in non-cellualr material samples

表 3 細(xì)胞類樣品支原體檢測(cè)統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistics for mycoplasma detection in cell samples

2.3 細(xì)胞類樣品支原體檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。在2015 年送檢的細(xì)胞樣品中，支原體檢出率高達(dá)13.5%。隨著實(shí)驗(yàn)人員的重視，細(xì)胞樣品的支原體檢出率逐漸降低，2019年僅為1.52%。圖2 顯示PCR 法對(duì)5 個(gè)細(xì)胞樣品的支原體檢測(cè)結(jié)果的電泳圖，其中泳道4～7 對(duì)應(yīng)的4 個(gè)細(xì)胞樣品未檢測(cè)出支原體，泳道8 對(duì)應(yīng)的1 個(gè)細(xì)胞樣品支原體陽(yáng)性。

圖 2 細(xì)胞樣品PCR法檢測(cè)支原體電泳結(jié)果Figure 2 Results of electrophoresis of PCR products after mycoplasma detection in cell samples

2.4 實(shí)驗(yàn)材料中攜帶的細(xì)菌種類鑒定

為探究實(shí)驗(yàn)材料帶入細(xì)菌的類型，2019 年選取了20 份細(xì)菌檢測(cè)陽(yáng)性樣品，對(duì)樣品中含有的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。20 份樣品共隨機(jī)挑取了34 個(gè)單克隆菌落，提取相應(yīng)基因組DNA，PCR 擴(kuò)增后測(cè)序比對(duì)，從中鑒定出的細(xì)菌種類及數(shù)量見(jiàn)表4。樣品攜帶細(xì)菌以葡萄球菌屬的細(xì)菌居多；34 個(gè)單克隆菌落中，12 個(gè)為緩慢葡萄球菌，8 個(gè)為腐生葡萄球菌。

表 4 細(xì)菌類別鑒定結(jié)果Table 4 Results of identification of bacterial species

3 討論

本單位動(dòng)物屏障設(shè)施現(xiàn)保養(yǎng)有13 000 籠實(shí)驗(yàn)小鼠，至今持續(xù)運(yùn)行已7 年多，設(shè)施內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量始終符合SPF等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求，這與從2015 年開(kāi)始進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)材料檢控措施有密切關(guān)系。本單位規(guī)定研究人員向屏障內(nèi)傳遞實(shí)驗(yàn)材料后，必須在屏障內(nèi)將樣品分裝備檢，同時(shí)提供課題組、實(shí)驗(yàn)人員姓名、樣品名稱、送檢日期等信息。當(dāng)細(xì)菌檢測(cè)陽(yáng)性或細(xì)胞支原體檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室會(huì)通知研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)材料制備過(guò)程進(jìn)行整改，接觸過(guò)陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)材料的小鼠須移出屏障設(shè)施。如果同一實(shí)驗(yàn)人員帶入的實(shí)驗(yàn)材料在1 年內(nèi)累計(jì)出現(xiàn)3 次陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，則該實(shí)驗(yàn)人員不能在動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)繼續(xù)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。該措施實(shí)行5 年來(lái)，檢測(cè)的樣品總量逐年增多，但細(xì)菌和支原體陽(yáng)性的樣品數(shù)量和陽(yáng)性率均呈逐年下降趨勢(shì)，說(shuō)明對(duì)帶入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障設(shè)施內(nèi)實(shí)驗(yàn)材料的檢控措施有助于降低實(shí)驗(yàn)材料中微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

在做細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員會(huì)時(shí)刻注意無(wú)菌操作，但在做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)往往疏于對(duì)材料的除菌處理，容易出現(xiàn)細(xì)菌或支原體污染。通過(guò)規(guī)則制定和配套檢控措施，能使實(shí)驗(yàn)人員意識(shí)到控制實(shí)驗(yàn)材料中微生物的重要性并加以重視，可有效降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被污染的概率。一般實(shí)驗(yàn)材料可以通過(guò)高溫消毒或?yàn)V膜過(guò)濾處理，一些不耐高溫高壓的材料可通過(guò)輻照除菌。實(shí)踐中，須督促實(shí)驗(yàn)人員每次送檢帶入的實(shí)驗(yàn)材料樣品。收到樣品后須及時(shí)檢測(cè)，如不能及時(shí)檢測(cè)，需將樣品放置4 ℃冰箱保藏，但不宜超過(guò)1 d，以防樣品中細(xì)菌傳代增量。

支原體是清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠也必須排除的病原體，支原體的感染會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)物健康和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[2]。支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常遇到的難題，本設(shè)施要求實(shí)驗(yàn)人員對(duì)其細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行自檢，支原體陰性的細(xì)胞方可帶入屏障設(shè)施。一旦發(fā)現(xiàn)有支原體陽(yáng)性材料做過(guò)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相關(guān)小鼠須移出屏障設(shè)施?？紤]到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，本單位在實(shí)踐中設(shè)有一個(gè)小型設(shè)施，用于接納可能被污染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，避免造成支原體在控制嚴(yán)格的大型設(shè)施內(nèi)傳播。這樣可以降低出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果后對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，讓大部分實(shí)驗(yàn)人員能夠做到切實(shí)配合送檢，既能保護(hù)大型屏障設(shè)施內(nèi)的動(dòng)物，也不會(huì)引起動(dòng)物實(shí)驗(yàn)人員的抵觸。另外，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)支原體污染，實(shí)驗(yàn)人員往往會(huì)使用一些抗支原體的藥物加在培養(yǎng)液中進(jìn)行控制，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的藥物使用，細(xì)胞中的支原體會(huì)大幅減少，但是這樣的細(xì)胞系往往在停藥一段時(shí)間后又能被檢測(cè)到支原體。

為了探究收檢的實(shí)驗(yàn)材料所攜帶的細(xì)菌類別，本單位通過(guò)測(cè)序鑒定到12 種細(xì)菌。其中鏈球菌是SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠需排除的微生物，其余11種細(xì)菌未列入檢測(cè)排除項(xiàng)。這11 種細(xì)菌中，也有一些可影響人類或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物健康，應(yīng)加以關(guān)注。比如檢出次數(shù)最多的緩慢葡萄球菌曾被認(rèn)為不具有致病性，但越來(lái)越多的資料表明它是人類或許多動(dòng)物不可忽視的致病菌，對(duì)于免疫力低下的人群或動(dòng)物可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，并能引起實(shí)驗(yàn)小鼠的慢性死亡[3]；木糖葡萄球菌廣泛分散于自然界，以往認(rèn)為是非致病菌，但此菌引起的感染時(shí)有報(bào)道[4]；產(chǎn)酸克雷伯菌雖未像肺炎克雷伯菌那樣須在SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠中排除，但該菌同樣是重要的條件致病菌，主要寄生在人和動(dòng)物的呼吸道和腸道，而實(shí)驗(yàn)小鼠也對(duì)該菌易感[5]。由此可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料中攜帶微生物的種類非常多樣，因此一定要預(yù)先無(wú)菌處理，將其對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的危害降到最低。后續(xù)本單位將繼續(xù)檢控實(shí)驗(yàn)材料，當(dāng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，進(jìn)一步探究不同實(shí)驗(yàn)材料中容易攜帶的微生物種類，以便進(jìn)一步探討其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康可能產(chǎn)生的影響。

總之，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料都將與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物直接接觸，其攜帶微生物的污染勢(shì)必影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康，進(jìn)而影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，還可能造成動(dòng)物發(fā)病，并在屏障設(shè)施內(nèi)傳播，所以對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行檢控也就顯得必要和重要。本單位持續(xù)多年對(duì)實(shí)驗(yàn)材料檢控的做法，有效保障了SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量和設(shè)施安全，這一經(jīng)驗(yàn)對(duì)類似動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障設(shè)施的運(yùn)行管理具有參考意義。