張 誠(chéng)，郭承意，周 雷，仝麗娜，文 英，李增魁，張紅見(jiàn)，賀曉龍，賈躍寧，康 明，高小龍

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810000)

H9N2亞型禽流感(avian influenza,AI)是目前全世界養(yǎng)禽業(yè)流行最廣泛的低致病性禽流感,自20世紀(jì)60年代從美國(guó)火雞上分離鑒定出H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)以來(lái)，該病毒迅速擴(kuò)散至世界各地[1-3]。我國(guó)于20世紀(jì)90年代中期首次從廣東省分離到該病毒，之后在全國(guó)雞群中廣泛流行[4]。雖然H9N2 AIV致病性較低，雞群感染后死亡率不到20%，但往往會(huì)引起產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。同時(shí),H9N2 AIV存在感染人的風(fēng)險(xiǎn)，還可為其他AIV病毒重組提供機(jī)會(huì)，對(duì)公共衛(wèi)生安全的潛在性威脅不容忽視[6]。因此，加強(qiáng)H9N2 AIV的防控刻不容緩。目前，防控H9N2 AIV的主要措施是接種滅活疫苗，但是由于AIV病毒變異性強(qiáng)，在疫苗免疫的壓力下易發(fā)生抗原漂移和替換，加上疫苗株和流行毒株不匹配等問(wèn)題，導(dǎo)致免疫雞群感染H9N2 AIV的情況時(shí)有發(fā)生[7-11]。因此，開(kāi)發(fā)新的預(yù)防性和治療性生物制劑很有必要。

納米抗體(nanobodies,Nbs)是天然存在的具有抗原識(shí)別功能的最小的抗體片段，來(lái)源于20世紀(jì)90年代Hamers等[12]發(fā)現(xiàn)的重鏈抗體(heavy chain antibodies,HCAbs)。重鏈抗體可變區(qū)(variable domain of camelid heavy-chain antibody,VHH)的分子質(zhì)量?jī)H有15 ku，體積在納米級(jí)，因此也稱為Nbs。由于Nbs分子質(zhì)量小，只有常規(guī)抗體的1/10，因此具有許多傳統(tǒng)抗體無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，如穩(wěn)定性強(qiáng)，能耐90 ℃高溫和極端pH等環(huán)境；親和力高，與抗原結(jié)合的親和力可達(dá)納摩爾級(jí)，甚至皮摩爾級(jí)；可識(shí)別常規(guī)抗體不易識(shí)別的結(jié)構(gòu)和表位，如酶的裂隙和其他抗原的凹槽等；適于通過(guò)原核或真核表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模制備，成本低廉，且穿透力強(qiáng)、免疫原性低[13]。因此，Nbs是病毒性疾病診斷和治療的理想分子，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)H9N2 AIV Nbs的報(bào)道。為此，本研究構(gòu)建了H9N2 AIV Nbs酵母雙雜交文庫(kù)，并評(píng)價(jià)了文庫(kù)質(zhì)量，以期為后期篩選H9N2 AIV Nbs奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試 劑 淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自GE公司；總RNA抽提試劑盒、2 000 DNA Maker和5 000 DNA Marker、2×TaqMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SD/-Leu培養(yǎng)基、YeastmakerTMYeast Transformation試劑盒，購(gòu)自Clontech公司；DMSO、甘油，購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖，購(gòu)自TaKaRa公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。

1.1.2 菌株、載體及疫苗 Y187酵母菌、pGADT7-Rec質(zhì)粒，購(gòu)自Clontech公司；H9禽流感(F株)滅活疫苗，購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司；H9亞型AIV陽(yáng)性血清，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；H9N2病毒，由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 H9N2 AIV抗體陰性的6月齡雌性雙峰駝1匹，購(gòu)自甘肅武威。

1.2 動(dòng)物免疫

將雙峰駝保定，臀部肌肉多點(diǎn)注射H9 AIV滅活疫苗15 mL，連續(xù)免疫4次，每次間隔2周。第4次免疫后2周，頸靜脈采血5～10 mL，分離血清，以H9N2 AIV為4單位抗原(hemagglutination unit,HAU)，用血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition assay,HI)評(píng)價(jià)免疫效果，同時(shí)設(shè)立H9亞型AIV陽(yáng)性血清、體積分?jǐn)?shù)1%紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)和4 HAU對(duì)照。當(dāng)HI抗體滴度大于1∶24時(shí)，采集新鮮抗凝血100～200 mL，用于分離淋巴細(xì)胞。

1.3 淋巴細(xì)胞分離、總RNA提取及cDNA合成

將新鮮抗凝血與等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水輕柔混勻，加入淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分離的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取約108個(gè)淋巴細(xì)胞，用RNA提取試劑盒抽提總RNA，測(cè)定RNA的質(zhì)量濃度為590 ng/μL,A260/A280為1.95。取1～3 μg總RNA，以O(shè)ligo(dT)為引物，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Nbs基因的巢式PCR擴(kuò)增

參考GenBank上公布的Nbs基因序列及文獻(xiàn)[14]，設(shè)計(jì)合成F/R、Nano-F/Nano-R和T7/3’AD 3對(duì)引物，引物F的序列為：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG，R的序列為：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；Nano-F的序列為：TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCT-GGRGGAGG，Nano-R的序列為：GTATCGATGCC-CACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAG-ACGGTGACCWGGGT，其中加粗的斜體部分表示同源臂；T7的序列為：TAATACGACTCACTATAGGG，3’AD的序列為：AGATGGTGCACGATGCACAG。3對(duì)引物中，引物F/R用于擴(kuò)增駱駝體內(nèi)常規(guī)抗體VH-CH1-hinge-CH2區(qū)(900 bp)和重鏈抗體VHH-hinge-CH2區(qū)(600 bp)；引物Nano-F/Nano-R用于從VHH-hinge-CH2片段中擴(kuò)增VHH基因，即Nbs基因(400 bp)；T7/3’AD為通用引物，用于插入片段的鑒定。

以淋巴細(xì)胞的cDNA為模板，以F和R為引物，PCR擴(kuò)增重鏈抗體VHH-hinge-CH2區(qū)，并設(shè)立滅菌水為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：F和R引物各1 μL，2×TaqMix 25 μL，cDNA 2 μL，滅菌水補(bǔ)足50 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，預(yù)期出現(xiàn)900和600 bp 2條條帶，切膠回收600 bp的目的條帶。

以600 bp的膠回收產(chǎn)物為模板，以Nano-F和Nano-R為引物，PCR擴(kuò)增Nbs基因，并設(shè)立滅菌水為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：Nano-F和Nano-R引物各1 μL，2×TaqMix 25 μL，600 bp的膠回收產(chǎn)物3 μL，滅菌水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收400 bp的目的條帶，即為Nbs基因。根據(jù)Clontech公司Mate & PlateTMLibrary System說(shuō)明書(shū)，用醋酸鈉乙醇沉淀法濃縮膠回收Nbs基因，并用NanoDrop微量分光光度計(jì)測(cè)定濃縮后的DNA質(zhì)量濃度，使其達(dá)到0.1～0.25 μg/μL。

1.5 AIV Nbs酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建

將濃縮的20 μL(4.2 μg)Nbs基因與6 μL pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，詳細(xì)步驟參見(jiàn)YeastmakerTMYeast Transformation System 2說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布約90個(gè)直徑150 mm的SD/-Leu平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d；所有平板置于4 ℃冰箱預(yù)冷約4 h后，給每個(gè)平板加4 mL含體積分?jǐn)?shù)25%甘油的YPDA培養(yǎng)基，用涂菌棒緩慢地從培養(yǎng)基上刮下所有菌落，混合至錐形瓶中搖勻，分裝至1.5 mL EP管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆?，即得AIV Nbs酵母雙雜交文庫(kù)。

根據(jù)酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建說(shuō)明書(shū)，分別取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和最終構(gòu)建的文庫(kù)適量，10倍倍比稀釋后涂布SD/-Leu平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)各稀釋度平板上的菌落數(shù)，估算文庫(kù)庫(kù)容和滴度。

從上述SD/-Leu平板上長(zhǎng)出的克隆中，用滅菌槍頭隨機(jī)挑取23個(gè)直徑約3 mm的菌落，涂抹于1.5 mL EP管管壁，于微波爐中高火加熱50 s，-20 ℃冷凍4 min，重復(fù)5次，加15 μL滅菌水制備菌落PCR模板。以3’AD和T7為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，并設(shè)立滅菌水為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：3’AD和T7引物各1 μL，2×TaqMix 25 μL，模板2 μL，滅菌水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，評(píng)價(jià)文庫(kù)菌重組效率。最后隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，送生工生物(上海)工程股份有限公司測(cè)序，分析文庫(kù)序列特征是否符合Nbs序列特點(diǎn)以及多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 H9 AIV滅活疫苗的免疫效果

雙峰駝經(jīng)H9亞型禽流感(F株)滅活疫苗連續(xù)免疫4次后，HI試驗(yàn)測(cè)得血清抗體滴度為1∶29(圖1)，達(dá)到預(yù)期免疫效果要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 Nbs基因片段的擴(kuò)增

以制備的淋巴細(xì)胞cDNA為模板，用F和R為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示成功擴(kuò)增出大小分別為900 和600 bp的2條條帶(圖2)，切膠回收600 bp的條帶備用。

以回收的600 bp條帶產(chǎn)物為模板，用Nano-F和Nano-R引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收，結(jié)果(圖3)顯示成功擴(kuò)增出400 bp的Nbs基因片段。

4HAU.4單位抗原對(duì)照；RBC.1%紅細(xì)胞對(duì)照

M.2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～8.PCR產(chǎn)物；9.陰性對(duì)照

M.5 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～14.Nbs基因；15.陰性對(duì)照

利用醋酸鈉乙醇沉淀法濃縮膠回收Nbs基因后，經(jīng)測(cè)定，其質(zhì)量濃度為0.21 μg/μL，共計(jì)30 μL，滿足文庫(kù)構(gòu)建要求。

2.3 AIV Nbs酵母雙雜交文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

取濃縮的Nbs基因與pGADT7-Rec質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建AIV Nbs酵母雙雜交文庫(kù)，經(jīng)檢測(cè)，文庫(kù)庫(kù)容為2.4×108，文庫(kù)滴度為4.2×109CFU/mL。

收獲文庫(kù)時(shí)從SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取23個(gè)克隆，用3’AD和T7通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖4所示。圖4顯示，23個(gè)克隆中有22個(gè)含Nbs基因，插入重組效率為95.6%。

M.2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～23.隨機(jī)挑取的23個(gè)克??；24.陰性對(duì)照

從上述PCR產(chǎn)物中隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性條帶，膠回收后測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖5所示。圖5顯示，在骨架1區(qū)(Framework region 1,FR1)和FR3區(qū)存在特征性半胱氨酸，可形成額外的二硫鍵。同時(shí)，在FR2區(qū)37位(Val→Phe/Tyr)、44位(Gly→Glu/Gln)、45位(Leu→Arg)和47位(Trp→Gly/Phe/Leu)發(fā)生了疏水性氨基酸向親水性氨基酸的替換，且10個(gè)序列各不相同，均為獨(dú)立克隆。

推導(dǎo)氨基酸序列根據(jù)Kabat編號(hào)進(jìn)行比對(duì)分析;1～10為隨機(jī)挑取的10個(gè)克隆;灰色標(biāo)記的為差異性氨基酸；“-”表示氨基酸缺失；實(shí)線框標(biāo)記的為Nbs序列中2個(gè)特征性半胱氨酸；虛線框標(biāo)記的為Nbs序列FR2區(qū)中的4個(gè)特征性氨基酸殘基

3 討 論

疫苗免疫是H9N2 AIV防控的主要措施，但是由于AIV病毒抗原變異性強(qiáng)，免疫雞群感染H9N2 AIV仍時(shí)有發(fā)生，且H9亞型存在感染人的風(fēng)險(xiǎn)[6-11]，因此，探究H9N2 AIV抗原變異的分子機(jī)制、鑒定保守表位、開(kāi)發(fā)廣譜疫苗和治療性制劑迫在眉睫。與常規(guī)單克隆抗體相比，Nbs在揭示新的抗原表位、感染性疾病診斷和治療上具有明顯優(yōu)勢(shì)。Gong等[15]篩選了H7N2的Nbs，并建立了基于Nbs的H7N2 AIV快速檢測(cè)方法。Ibanez等[16]篩選了具有體外中和活性的H5N1 AIV Nbs。Gao等[17]通過(guò)酵母雙雜交篩選了新城疫病毒HN蛋白的Nbs。2019年2月，F(xiàn)DA正式批準(zhǔn)了賽諾菲旗下用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜的Nbs Caplacizumab，成為全球上市的第一個(gè)Nbs藥物。

抗體文庫(kù)大體可分為兩類，一種是免疫文庫(kù)，另一種是非免疫文庫(kù)。在非免疫文庫(kù)構(gòu)建中，由于抗體基因來(lái)自天然(未經(jīng)主動(dòng)免疫)的動(dòng)物免疫細(xì)胞，因此抗體序列信息能反映動(dòng)物本身抗體序列的多樣性特點(diǎn)，理論上可以篩選任何抗原的抗體[18]。而免疫文庫(kù)中的抗體基因來(lái)自經(jīng)特定抗原刺激的免疫細(xì)胞，其靶向特定抗原的抗體序列得到富集，可篩選出種類更多、親和力更強(qiáng)的抗體[19]。免疫效果的好壞是構(gòu)建高質(zhì)量免疫抗體文庫(kù)的重要前提。本研究中，為獲得較好免疫效果，根據(jù)雙峰駝與雞體質(zhì)量的比例最終確定疫苗接種劑量為15 mL，且首免后又進(jìn)行了3次加強(qiáng)免疫，使最終HI抗體滴度可達(dá)1∶29，為構(gòu)建高質(zhì)量酵母雙雜交抗體文庫(kù)提供了保證。

抗體文庫(kù)構(gòu)建中，抗體片段與載體的克隆大多采用傳統(tǒng)的酶切連接方法，為克服酶切連接效率低、過(guò)程繁瑣且易受酶切位點(diǎn)限制等不足，本研究根據(jù)pGADT7-Rec載體序列，在Nbs擴(kuò)增引物兩端添加了同源臂，擴(kuò)增的Nbs基因片段與pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)Y187感受態(tài)后，通過(guò)同源重組可直接完成克隆，過(guò)程簡(jiǎn)單快捷[14]。經(jīng)鑒定，文庫(kù)的插入重組效率可達(dá)95.6%。

相對(duì)常規(guī)抗體重鏈可變區(qū)而言，Nbs序列有其顯著特征。首先，在FR2區(qū)37位(Val→Phe/Tyr)、44位(Gly→Glu/Gln)、45位(Leu→Arg)和47位(Trp→Gly/Phe/Leu)存在疏水性氨基酸向親水性氨基酸的轉(zhuǎn)換，增加了FR2區(qū)的親水性，彌補(bǔ)了輕鏈缺失導(dǎo)致的缺點(diǎn)，改善了Nbs的穩(wěn)定性、可溶性、易聚集性。本研究構(gòu)建的Nbs文庫(kù)序列在FR2區(qū)均存在上述位點(diǎn)的氨基酸替換，與先前的報(bào)道[13]一致。其次，Nbs擁有較長(zhǎng)的CDR3區(qū)，平均為16～18個(gè)氨基酸，但也有部分Nbs的CDR3區(qū)較短。本研究隨機(jī)挑取的10個(gè)Nbs中，有4個(gè)CDR3區(qū)由16個(gè)氨基酸構(gòu)成，有1個(gè)CDR3區(qū)由3個(gè)氨基酸構(gòu)成，與Vu等[20]的報(bào)道相符合。較長(zhǎng)的CDR3區(qū)不僅可增加Nbs的穩(wěn)定性和可溶性，也有助于識(shí)別一些常規(guī)抗體不易識(shí)別的抗原位點(diǎn)，如酶的裂隙和其他抗原的凹陷部位等。

文庫(kù)庫(kù)容和多樣性直接影響到后期能否篩選到高質(zhì)量的抗體。對(duì)于免疫文庫(kù)而言，由于建庫(kù)時(shí)動(dòng)物經(jīng)過(guò)抗原免疫，使針對(duì)特定免疫原的B細(xì)胞得到了很好地富集，因此抗體庫(kù)庫(kù)容一般達(dá)到106，甚至105即可。本研究中，文庫(kù)庫(kù)容為2.4×108，文庫(kù)插入重組率為95.6%,且均為獨(dú)立克隆，表明構(gòu)建的文庫(kù)庫(kù)容和多樣性良好，為下一步篩選H9N2 AIV Nbs奠定了基礎(chǔ)。