黃興發(fā)，尹 躍，，趙建華，姚佳依，秦小雅，汪淑芬，曹有龍，戰(zhàn)祥強(qiáng)

(1西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院 國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)系茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生落葉多棘刺灌木植物，主根系發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的抗旱性和耐鹽性[1-2]，主要分布在我國(guó)新疆、青海、甘肅、寧夏等西北地區(qū)鹽堿地、沙漠、路邊等，是西北地區(qū)水土保持的先鋒樹種[3],其果實(shí)富含豐富的花青素和多酚物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老等功效[4-8]，已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。近年來，國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心收集保存了黑果枸杞種質(zhì)資源，但這些資源遺傳背景復(fù)雜，限制了黑果枸杞的品種選育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，加強(qiáng)黑果枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建等研究，對(duì)黑果枸杞新品種選育及產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)又稱為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats，STR)或微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，廣泛存在于真核基因組中。SSR標(biāo)記因具有共顯性、多態(tài)性高、高通量數(shù)據(jù)易處理及易共享等優(yōu)點(diǎn)[9]，已廣泛應(yīng)用于山茶、白蠟等植物遺傳多樣性評(píng)價(jià)、核心種質(zhì)和遺傳圖譜構(gòu)建及重要性狀定位等研究領(lǐng)域[10-15]。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，大規(guī)模植物已完成全基因組測(cè)序[16]，人們基于全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)了大量的SSR標(biāo)記，且建立了SSR標(biāo)記檢索數(shù)據(jù)庫(kù)[17-19]，為SSR標(biāo)記的利用提供了快捷的途徑。而枸杞SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用的研究相對(duì)滯后，目前已從紅果枸杞中開發(fā)了一批多態(tài)性高的SSR標(biāo)記，并應(yīng)用于品種鑒定、分子指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性評(píng)價(jià)研究[20-26]。然而，由于物種間的擴(kuò)增效率不一樣，基于紅果枸杞開發(fā)的SSR引物在黑果枸杞屬植物擴(kuò)增效率較低，難以滿足黑果枸杞遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建等研究的需要。

基于此，本研究以2年生的黑果枸杞幼嫩葉片為材料，基于Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)，采用MISA軟件對(duì)測(cè)序組裝黑果枸杞基因組進(jìn)行掃描，設(shè)計(jì)開發(fā)并篩選出一批黑果枸杞SSR標(biāo)記，旨在用于黑果枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)及遺傳圖譜構(gòu)建等方面，為黑果枸杞新品種選育及產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

【注意事項(xiàng)】1.眼部、外陰等皮膚黏膜及破損處禁用。2.本品為外用藥，不可內(nèi)服。3.涂布部位如有明顯灼熱感或瘙癢、局部紅腫等情況應(yīng)停止用藥，洗凈，必要時(shí)向醫(yī)師咨詢。4.對(duì)本品過敏者禁用，過敏體質(zhì)者慎用。5.藥品性狀發(fā)生改變時(shí)禁止使用。6.兒童必須在成人的監(jiān)護(hù)下使用。7.請(qǐng)將本品放在兒童不能接觸的地方。8.如正在使用其他藥品，使用本品前咨詢醫(yī)師或藥師。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高通量測(cè)序所用材料為2年生的黑果枸杞Lr-01無性系(圖1)，表現(xiàn)為刺多，花量大，具有較強(qiáng)抗旱性和耐鹽性；引物篩選和多態(tài)性驗(yàn)證的材料為18份寧夏枸杞、1份中國(guó)枸杞、23份黑果枸杞和6份其他枸杞種質(zhì)(表1)，以上材料均定植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞種質(zhì)資源圃(38°38′49″N，106°09′10″E)。2018年5月采集幼嫩健康葉片用于基因組DNA提取。

A.整株 Whole plant；B.花 Flower；C.果實(shí) Fruit

表1 供試枸杞材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用試劑盒法(DP305，天根)從枸杞幼嫩葉片中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量完整性，紫外分光光度計(jì)(Eppendorf，Bio Photometer plus)檢測(cè)DNA濃度和純度，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃保存，用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

1.2.2 高通量測(cè)序與組裝分析 對(duì)質(zhì)檢合格基因組DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，由北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行PE150測(cè)序。測(cè)序完成后，過濾掉接頭污染、低質(zhì)量和含N比列大于5%的Reads。利用SOAP denovo軟件[27]進(jìn)行序列拼接和組裝。

1.2.3 SSR位點(diǎn)鑒別與引物設(shè)計(jì) 使用MISA軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)進(jìn)行SSR位點(diǎn)的搜索，搜索的標(biāo)準(zhǔn)為：重復(fù)基元長(zhǎng)度1～6 bp，單核苷酸重復(fù)基序的最小重復(fù)數(shù)為10；二核苷酸重復(fù)基序的最小重復(fù)數(shù)為6；三、四、五和六核苷酸重復(fù)基序的最小重復(fù)數(shù)均為5。兩個(gè)SSR序列間隔最小值為100 bp，即序列間隔。

D.被稱為路人甲的就是你啦。有時(shí)你會(huì)被無視，有時(shí)你會(huì)被遺忘。過于內(nèi)斂是你的缺點(diǎn)，你應(yīng)該適當(dāng)發(fā)表自己的意見，讓別人感覺到你的存在是非常必要的。

@春風(fēng)過柳綠如繰：有關(guān)部門好好查一查，把賺到的賠償金都弄到哪里去了?還有音集協(xié)收了錢真的交版權(quán)費(fèi)了嗎？

由圖4可以看出，當(dāng)k=2時(shí)，ΔK值最大，依據(jù)Evanno[34]提出的ΔK值分析方法，48份供試枸杞種質(zhì)可劃分為2個(gè)類群。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及多態(tài)性SSR引物篩選 PCR擴(kuò)增體系15 μL：50 ng/μL DNA模板1 μL，10×Buffer 1.5 μL，10 μmol/L dNTP 1.2 μL，5 μmol/L上游引物1 μL，5 μmol/L下游引物0.2 μL，5 μmol/L M13熒光引物0.8 μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.1 μL，滅菌后去離子水9.2 μL。

PCR反應(yīng)在Gene Amp PCR System 9600(Perkin Elmer，USA)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；最后60 ℃ 30 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過ABI3730XL DNA(Applied Biosystems，USA)檢測(cè)，采用LIZ-500作為分子量?jī)?nèi)標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用GeneMapper 4.0軟件對(duì)ABI3730XL收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得不同樣品擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度；采用DataFormater軟件[29]將擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)化為PowerMarker v3.25、NTSYS-pc2.20和STRUCTURE2.3.4輸入格式。由PowerMarker v3.25軟件[30]計(jì)算等位基因數(shù)(number of alleles,Na)、觀察雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)遺傳多樣性參數(shù)。用NTSYS-pc2.20軟件[31]計(jì)算種質(zhì)間的遺傳距離，然后將遺傳距離矩陣導(dǎo)入MEGA 6.06軟件，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制系統(tǒng)聚類樹,并用在線軟件iTOL(https://itol.embl.de/itol.cgi)編輯美化。用STRUCTURE2.3.4軟件[32]對(duì)48份枸杞材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置群體數(shù)k值為1～10，每個(gè)參數(shù)運(yùn)行10次，每次運(yùn)行的burn-in time設(shè)置為10 000，重復(fù)次數(shù)為100 000，得到ΔK值，繪制k與ΔK的關(guān)系圖。用STRUCTURE HARVESTER在線軟件[33]對(duì)群體種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析，用個(gè)體歸屬各組群的比例(Q值)與群體數(shù)(k)來研究供試枸杞種質(zhì)間是否存在基因交流。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞基因組中SSR位點(diǎn)數(shù)及分布頻率

根據(jù)多態(tài)性結(jié)果，從37對(duì)SSR引物中挑選出10對(duì)，分析其在48份材料中的遺傳參數(shù)，結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，共檢測(cè)到186個(gè)等位基因，最少12個(gè)，最多28個(gè)，平均19個(gè)；觀察雜合度為0.375～0.854，平均為0.615；期望雜合度為0.730～0.922，平均0.834；多態(tài)信息含量為0.692～0.917，平均0.817。表明供試枸杞種質(zhì)間具有豐富的遺傳多樣性。

在黑果枸杞基因組SSR位點(diǎn)中，以10次重復(fù)次數(shù)最多，達(dá)804個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的32.24%；其次為6和11次重復(fù)，SSR位點(diǎn)數(shù)分別為389和282，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的15.59%和11.30%(表2)。

表2 黑果枸杞基因組中1～6 bp核苷酸重復(fù)單元基序的SSR數(shù)量

2.2 黑果枸杞基因組中SSR基序類型和頻率

從黑果枸杞基因組SSR基序類型(表3)來看，2 494個(gè)SSR位點(diǎn)中共有21種重復(fù)基序，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序類型依次有2，3，7，2，5和2種。

表3 黑果枸杞基因組SSR基序類型的分布

利用NTSYS-pc2.20軟件計(jì)算48份枸杞種質(zhì)間的遺傳距離，然后用UPGMA法繪制系統(tǒng)聚類樹(圖3)。

2.3 枸杞基因組中多態(tài)性SSR引物的篩選

以表型差異較大的4份種質(zhì)‘寧杞1號(hào)’、‘Lc-01’、‘天精5號(hào)’和‘Lr-01’為材料，對(duì)設(shè)計(jì)合成的150對(duì)SSR熒光引物進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，其中37對(duì)引物表現(xiàn)出高的多態(tài)性，多態(tài)性比率為24.6%。以引物L(fēng)RSSR0018為例，其在4份種質(zhì)上擴(kuò)增熒光毛細(xì)管電泳圖見圖2。由圖2可知，引物L(fēng)RSSR0018在4份種質(zhì)間表現(xiàn)出高多態(tài)性。

寶清縣地下水可開采量25 612.13萬m3/a，目前地下水開采量24 173.39萬m3/a。地下水開發(fā)利用程度較高，為94%。寶清縣地下水開發(fā)利用程度高主要受寶清鎮(zhèn)、五九七農(nóng)場(chǎng)、八五三農(nóng)場(chǎng)井灌水田區(qū)的影響。寶清鎮(zhèn)地下水開發(fā)利用程度為161%，五九七農(nóng)場(chǎng)地下水開發(fā)利用程度為140%，八五三農(nóng)場(chǎng)井灌水田區(qū)地下水開發(fā)利用程度320%，除此以外寶清縣朝陽(yáng)鄉(xiāng)地下水開發(fā)利用程度81%，其余鄉(xiāng)鎮(zhèn)地下水開發(fā)利用程度低于65%，尚有開發(fā)利用空間。

不同加工方法牡丹皮中7種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià) …………………………………………… 張洪坤等（22）：3063

圖2 引物L(fēng)RSSR0018在4份枸杞材料中的毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4 枸杞基因組中SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

利用MISA軟件對(duì)組裝獲得2G數(shù)據(jù)量72 852條Scaffolds(序列總長(zhǎng)為13 187 545 bp)進(jìn)行查找分析，發(fā)現(xiàn)含有符合條件的SSR Scaffolds有2 326條，發(fā)生頻率為3.19%。共查到2 494個(gè)SSR位點(diǎn)，分布頻率為3.42%，其中每5.29 kb就具有1個(gè)SSR位點(diǎn)。黑果枸杞基因組中SSR類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在。其中，單核苷酸重復(fù)類型數(shù)量最多，為1 476個(gè)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的59.18%；其次為二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型，分別為676和293個(gè)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的27.11%和11.75%；四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量很少，總共僅占總SSR位點(diǎn)數(shù)的1.96%。由此可見，黑果枸杞基因組SSR重復(fù)基元的數(shù)量隨著堿基重復(fù)次數(shù)的增加呈降低趨勢(shì)(表2)。

表4 10個(gè)SSR標(biāo)記在48份枸杞材料中的遺傳參數(shù)

2.5 48份枸杞種質(zhì)間的系統(tǒng)聚類分析

單核苷酸中基序類型以A/T為主，占總SSR位點(diǎn)類型的56.05%。二核苷酸重復(fù)基序類型有3種，即AC/GT、AG/CT和AT/AT，其中AT/AT基序所占的比例最高，為12.35%。三核苷酸重復(fù)基序類型有7種，其中AAC/GTT重復(fù)基序類型最多有133個(gè)(5.33%)，ACC/GGT重復(fù)基序類型最少有4個(gè)(0.16%)。四核苷酸重復(fù)基序類型以AAAG/CTTT(6個(gè)，0.24%)和ACAT/ATGT(6個(gè)，0.24%)為主。五核苷酸重復(fù)基序類型以AATTC/AATTG(12個(gè)，0.48%)和ATATC/ATATG(12個(gè)，0.48%)為主。六核苷酸重復(fù)基序類型以ACTGCT/AGCAGT(8個(gè)，0.32%)為主(表3)。

圖3 基于UPGMA法構(gòu)建的48份枸杞種質(zhì)的系統(tǒng)聚類樹

由圖3可知，48份枸杞種質(zhì)被劃分為Ⅰ和Ⅱ 2個(gè)類群。類型Ⅰ中含有23份種質(zhì)，全部是黑果枸杞。類型Ⅱ中包括25份種質(zhì)，大部分為寧夏枸杞，其中寧杞5號(hào)與寧杞10號(hào)、蒙杞1號(hào)與蒙杞2號(hào)、寧杞菜1號(hào)與寧杞9號(hào)親緣關(guān)系最近，這與其來源及遺傳背景相符合；5份黃果枸杞聚為一小分枝，果實(shí)顏色均為黃色，果形為近球形。天精3號(hào)和天精5號(hào)親緣關(guān)系較近，與其他種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這2份種質(zhì)為軟枝型，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，葉片肥大。本研究分類結(jié)果與形態(tài)聚類結(jié)果相一致。

2.6 48份枸杞種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析

對(duì)于實(shí)施分層管理模式前后患者的滿意度、護(hù)理人員自身的滿意度、醫(yī)生對(duì)于護(hù)士的滿意度、護(hù)理部門質(zhì)控檢查的平均成績(jī)等進(jìn)行調(diào)查和比較,前后存在有明顯的差異性,P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳細(xì)情況請(qǐng)參見表1所示。

運(yùn)用Primer 3.0軟件[28]進(jìn)行引物批量設(shè)計(jì)。隨機(jī)選擇150對(duì)引物按照以下參數(shù)設(shè)計(jì)：引物長(zhǎng)度18～27 bp，GC含量在40%～60%，退火溫度50～60 ℃，上、下游引物的退火溫度相差不超過5 ℃。在上游引物5′端添加18 bp的M13通用引物序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，3′端保持不變，F(xiàn)AM和HEX兩種熒光基團(tuán)修飾通用引物，所有引物均由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

采用STRUCTURE HARVESER在線軟件分析后，將48供試枸杞種質(zhì)分成2個(gè)不同的群體結(jié)構(gòu)，不同顏色表示不同的類群，分別用S1(白色)和S2(灰色)表示(圖5)。

由圖5可知，S1類群包括25份種質(zhì)，含有23份黑果枸杞、天精3號(hào)和天精5號(hào)，占類群總數(shù)的52%。多數(shù)種質(zhì)的Q值大于0.95(除了18號(hào)種質(zhì)(中科綠川1號(hào)))，表明種質(zhì)來源單一，與其他種質(zhì)基本無基因交流。18號(hào)種質(zhì)(中科綠川1號(hào))雖隸屬寧夏枸杞，但因其含有40.8%的S2遺傳背景，因此本研究將其劃分在S2類群中。

式中：cF為折減后的總黏聚力；φF為折減后的內(nèi)摩擦角；kF為折減后的DP5總黏聚力；αF為折減后的DP5內(nèi)摩擦角；Ftrial為折減系數(shù)。

由圖5還可知，S2類群包括23份種質(zhì)，含有18份寧夏枸杞、1份中國(guó)枸杞和4份其他種質(zhì)，占類群總數(shù)的48%。其中11號(hào)和19號(hào)2份種質(zhì)分別含有39.7%和46.5%的S1遺傳背景，而11號(hào)為三倍體菜用枸杞寧杞菜1號(hào)，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，發(fā)枝量大；19號(hào)為中國(guó)枸杞Lc-01，果實(shí)形狀與黑果枸杞屬植物相近，為圓形果實(shí)，適應(yīng)性強(qiáng)，在全國(guó)廣泛分布。

圖4 48份枸杞種質(zhì)資源中群體數(shù)(k)與ΔK關(guān)系

圖5 48份枸杞種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)

3 討 論

本研究利用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)黑果枸杞無性系Lr-01基因組進(jìn)行PE150測(cè)序，獲得總數(shù)據(jù)量為2G；利用MISA軟件共檢索到2 494個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每5.29 kb就出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)，與紅果枸杞[24]及茄科其他植物，如茄子[35]、辣椒[36]、馬鈴薯[37]和煙草[38]等植物相比，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率較低，這可能與本研究測(cè)序數(shù)據(jù)量大小及檢索標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)[38]。

本研究中，黑果枸杞基因組中優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元類型為單核苷酸(59.18%)、二核苷酸(27.11%)和三核苷酸(11.75%)，而四、五和六核苷酸總計(jì)占1.96%。在重復(fù)單元類型中，以A/T、AC/GT、AT/AT和AAC/GTT出現(xiàn)頻率最高，說明黑果枸杞基因組SSR序列中富含有A和T堿基。這與紅果枸杞、棗等植物中SSR基序分布規(guī)律一致[24,39]。

目前，基于高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于SSR標(biāo)記開發(fā)，而SSR標(biāo)記最廣泛應(yīng)用是種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[9,12,40]。本研究從2 494個(gè)SSR位點(diǎn)中設(shè)計(jì)開發(fā)出150對(duì)SSR引物，最終挑選出10對(duì)多態(tài)性高的SSR引物應(yīng)用于48份枸杞種質(zhì)遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到186個(gè)等位基因，多態(tài)信息含量(PIC)均大于0.5，屬于高度多態(tài)性SSR引物[41]。本研究用篩選出的10對(duì)SSR引物對(duì)48份種質(zhì)聚類分析結(jié)果與遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相一致，與基于紅果枸杞開發(fā)SSR標(biāo)記[23,26]及SCoT[42]和SRAP標(biāo)記[43]研究結(jié)果相一致。說明篩選出的10對(duì)SSR引物質(zhì)量較高，并且在物種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增效率較高。

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息分析，開發(fā)了黑果枸杞基因組SSR標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)分析黑果枸杞基因組SSR數(shù)量、長(zhǎng)度、頻率等特征，設(shè)計(jì)開發(fā)了一批SSR引物，豐富了黑果枸杞分子標(biāo)記類型。但由于測(cè)序數(shù)據(jù)量小，開發(fā)及篩選出具有多態(tài)性SSR標(biāo)記較少。因此，今后研究需要加測(cè)數(shù)據(jù)量，篩選出大量具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，且建立黑果枸杞SSR標(biāo)記檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，既為黑果枸杞遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供SSR標(biāo)記支撐，也為黑果枸杞種質(zhì)資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)，對(duì)推動(dòng)黑果枸杞新品種選育及產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。