沃奇軍 項(xiàng) 飛 張大宏

腎細(xì)胞癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎腺癌，占腎惡性腫瘤的80%～90%，是泌尿系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一[1-2]。腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，而放化療藥物在臨床使用過程中均不敏感，導(dǎo)致患者整體生存率無法提高[3]。腫瘤細(xì)胞的抗凋亡是放化療藥物不敏感的重要因素，腫瘤細(xì)胞的凋亡分為多種，而在腎細(xì)胞癌中，抗失巢凋亡是腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵因素[4-5]。近年研究表明，許多中藥在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[6-7]。此前研究發(fā)現(xiàn)，紫草提取物紫草素在多種腫瘤中具有顯著的抗腫瘤作用[8-17]。本研究探究紫草素對腎細(xì)胞癌凋亡和抗失巢凋亡的可能作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 786-O [786-0]人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞（2019 年新引進(jìn)）由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供。培養(yǎng)于10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 中 藥 紫草素（批號5156421）購自成都曼斯特生物科技有限公司。將紫草素利用PBS 溶解成1mg/mL 儲液于-80℃保存。低劑量組設(shè)置為1μg/mL，中劑量組設(shè)置為2μg/mL，高劑量組設(shè)置為4μg/mL。對照組加入相應(yīng)體積的PBS。

1.3 試 劑 CCK8 細(xì)胞活力檢測試劑盒（批號265189）購自北京索萊寶科技有限公司；軟瓊脂（批號87183）購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；poly-HEMA（批號2316a）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；PI-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（批號237236）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；局部粘著斑激酶（FAK，批號454683）、磷酸化局部粘著斑激酶（p-FAK，批號252454）、蛋白激酶B（Akt，批號54861）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt，批號564684）、Src 蛋白（Src，批號2487）、磷酸化Src 蛋白（p-Src，批號483452）、糖原合酶激酶3β（GSK3b，批號68a326）、磷酸化糖原合酶激酶3β（p-GSK3b，批號65821）單抗均購自CST，actin 作為內(nèi)參。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK8 檢測腎透明癌細(xì)胞活力 將紫草素溶液786-O 人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按2000/孔鋪板于96 孔板中。紫草素溶液分為四組，分別為對照組、低劑量組（1μg/mL）、中劑量組（2μg/mL）和高劑量組（4μg/mL），每組5 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞鋪板生長過夜后加入紫草素，48h 后檢測加入CCK8 孵育2h，測定450nmol 處吸光度值。

2.2 軟瓊脂細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn) 同上分為四組，將藥物與DMEM 稀釋的軟瓊脂稀釋液混合后重懸消化離心的細(xì)胞，細(xì)胞密度設(shè)置為2000 個(gè)/mL。鋪板于24孔板中，37℃培養(yǎng)7 天后取出拍照，每組設(shè)置10 個(gè)復(fù)孔，每個(gè)復(fù)孔選取5 個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞集落數(shù)。細(xì)胞數(shù)＞30 記為一個(gè)集落。

2.3 Poly-HEMA 細(xì)胞條件培養(yǎng) 同上實(shí)驗(yàn)分為4組，將poly-HEMA 2mL 加入6 孔板中，37℃保存，10min 后加入786-O 人腎細(xì)胞癌單細(xì)胞懸液。24h 后觀察細(xì)胞聚團(tuán)情況。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測786-O 人腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡將收集的786-O 人腎細(xì)胞癌細(xì)胞用PBS 稀釋至5×106個(gè)/mL。按照PI-Annexin V 凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作。

2.5 細(xì)胞caspase-3 活力檢測 將786-O 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后接種在鋪有膠原蛋白或非粘附性poly-HEMA 的96 孔板上，包括空白組（只含培養(yǎng)基），對照組，低、中、高劑量組，陽性對照組[暴露于TRAIL（100ng）+Velcade（100nmol/L）處理16h]，于37℃培養(yǎng)箱孵育6～24h。根據(jù)Caspase-Glo 3/7 測定法用試劑盒檢測caspase-3 的活化。主要步驟為在開始測定之前，準(zhǔn)備Caspase-Glo 3/7 試劑，使試劑平衡至室溫，拌勻。從培養(yǎng)箱中取出裝有已處理細(xì)胞的96 孔板，平衡至室溫。將100μL Caspase-Glo 3/7 試劑加到96 孔板的每個(gè)孔中。在平板振蕩器中以300～500rpm 輕輕混合溶液30s，在室溫下孵育2h 后進(jìn)行照度計(jì)讀數(shù)。

2.6 Western blot 檢測FAK、Akt、Src、GSK3b 蛋白磷酸化情況 收集藥物處理48h 的細(xì)胞，裂解蛋白測定蛋白濃度，加入6X loading，100℃煮10min 后上樣。每孔蛋白上樣量20μg，經(jīng)過SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)膜封閉，4℃過夜孵育一抗（一抗稀釋比均為1:1000）。TBST 洗膜后孵育熒光二抗1h，在odyssey熒光掃膜儀進(jìn)行顯影。

2.7 RT-PCR 檢測FasL、Bim mRNA 表達(dá) 將高劑量紫草素處理48h 的細(xì)胞，通過trizol 法提取細(xì)胞RNA 后逆轉(zhuǎn)為cDNA，使用SYBR Green 法進(jìn)行熒光定量PCR。PCR 程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性15s；60℃退火30s；72℃延伸15s。以GAPDH 作為內(nèi)參。引物購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，引物詳細(xì)序列如下：GAPDH（上游引物：5' TGTGGGCATCAATGGATTTGG 3'；下游引物：5' ACACCATGTATTCCGGGTCAAT 3'）、FasL（上游引物：5' TGCCTTGGTAGGATTGGGC 3'；下游引物：5' GCTGGTAGACTC-TCGGAGTTC 3'）、Bim（上游引物：5' CATATAACCCCGTCAACGCAG 3'；下游引物：5' GCAGCCGCCACAAACATAC 3'）。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 紫草素對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞活力的影響 與對照組比較，中、高劑量紫草素均能顯著抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞活力（P＜0.01）。見表1。

3.2 紫草素對集落形成的影響 與對照組比較，紫草素低、中、高劑量組細(xì)胞集落數(shù)明顯減少（P 均＜0.01），且呈劑量依賴性下降。見表2。

3.3 紫草素對poly-HEMA 條件下細(xì)胞聚集的影響 786-O 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞在Poly-HEMA 中，分別加入低、中、高劑量的紫草素培養(yǎng)24h，在倒置微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可觀察到對照組細(xì)胞大部分成團(tuán)聚集，而低、中、高劑量組細(xì)胞聚團(tuán)減少，尤其在高劑量紫草素處理后，細(xì)胞幾乎不形成聚團(tuán)。見圖1。

表1 CCK8 檢測各組細(xì)胞活力比較（%，）

表1 CCK8 檢測各組細(xì)胞活力比較（%，）

注：對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL 紫草素處理24h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL 紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.01

表2 各組細(xì)胞集落數(shù)比較（個(gè)，）

表2 各組細(xì)胞集落數(shù)比較（個(gè)，）

注：對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL 紫草素處理24h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL 紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.01

圖1 紫草素對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞聚集的作用

3.4 紫草素對poly-HEMA 條件下細(xì)胞凋亡的影響低劑量組（8.04±0.98）%、中劑量組（19.35±1.22）%及高劑量組（35.25±1.35）%與對照組（0.40±0.52）%比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

3.5 紫草素對caspase-3 活力的影響 紫草素處理鋪于膠原蛋白上的786-O 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞能明顯降低caspase-3 活力（P＜0.05，P＜0.01）。同時(shí)鋪板于非粘附性poly-HEMA 的細(xì)胞caspase-3 活性也隨著紫草素劑量的增加而增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表3-4。

圖2 紫草素對腎透明細(xì)胞癌失巢凋亡的作用

表3 紫草素對粘附生長腎透明細(xì)胞癌caspase-3 活力的影響（）

表3 紫草素對粘附生長腎透明細(xì)胞癌caspase-3 活力的影響（）

注：空白組為只含培養(yǎng)基；對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL紫草素處理24h；陽性對照組為TRAIL（100ng）+Velcade（100nmol/L）處理16h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表4 紫草素對非粘附生長腎透明細(xì)胞癌caspase-3 活力的影響（）

表4 紫草素對非粘附生長腎透明細(xì)胞癌caspase-3 活力的影響（）

注：空白組為只含培養(yǎng)基；對照組為PBS 處理24h；低劑量組為1μg/mL紫草素處理24h；陽性對照組為TRAIL（100ng）+Velcade（100nmol/L）處理16h；中劑量組為2μg/mL 紫草素處理24h；高劑量組為4μg/mL紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

圖3 紫草素抑制786-O 腎透明細(xì)胞癌FAK/Akt/Src/GSK3b信號活化

3.6 紫草素對FAK、Akt、Src、GSK3b 信號激活的影響 Western blot 結(jié)果顯示，紫草素能明顯降低786-O 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞FAK、Akt、Src、GSK3b 的磷酸化激活，與對照組比較均有顯著性差異，且信號軸活化水平與紫草素的濃度存在劑量依賴性。見圖3。

3.7 紫草素對凋亡信號靶基因FasL、Bim 表達(dá)的影響 高劑量紫草素能明顯降低FasL、Bim 轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.01）。見表5。

表5 FasL、Bim 轉(zhuǎn)錄水平相對表達(dá)量比較（）

表5 FasL、Bim 轉(zhuǎn)錄水平相對表達(dá)量比較（）

注：對照組為PBS 處理24h；高劑量組為4μg/mL 紫草素處理24h；與對照組比較，aP＜0.01

4 討論

目前臨床腎細(xì)胞癌的治療策略以放化療為主，但是腎細(xì)胞癌對放療和化療均不敏感的問題一直存在，其中一個(gè)重要的原因即腎細(xì)胞癌異常的抗凋亡能力[11，13]。

紫草素在眾多腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用[8-12]。本研究通過CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，紫草素能有效抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞活力。進(jìn)一步通過軟瓊脂細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)和poly-HEMA 條件培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)紫草素能明顯抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞失巢凋亡抵抗的能力。且這種作用具有劑量梯度依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量的紫草素均能明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步明確了紫草素對腎細(xì)胞癌抗凋亡能力的抑制作用。事實(shí)上，紫草素的抗凋亡作用在其他腫瘤中也存在類似的研究，Wu 等[14]發(fā)現(xiàn)，低劑量紫草素能誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞caspase 信號活化，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，此外紫草素對肺癌、前列腺癌等多種細(xì)胞也有類似的作用[15]。因此，對紫草素的進(jìn)一步體內(nèi)研究將有利于促進(jìn)紫草素成為新型腫瘤治療潛在藥物。

經(jīng)典的細(xì)胞凋亡分子機(jī)制為p53 激活促凋亡蛋白Bax，Bax 導(dǎo)致細(xì)胞色素C 的釋放和caspase 的活化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制紫草素能明顯升高腎細(xì)胞癌在貼壁和懸浮狀態(tài)下caspase-3 活性。同時(shí)通過檢測抗凋亡相關(guān)信號FAK、Akt、Src、GSK3b 的磷酸化激活，紫草素作用后明顯抑制了相關(guān)信號的激活，通過對凋亡信號下游靶基因表達(dá)的定量檢測我們發(fā)現(xiàn)下游靶基因FasL、Bim 促凋亡分子的表達(dá)明顯升高，提示紫草素可能通過抑制抗凋亡信號并增強(qiáng)促凋亡信號達(dá)到抑制腎細(xì)胞癌的作用。