肖昌瓊，陳 銳

（湖南省郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科，湖南 郴州 423000）

植物雌激素是具有弱雌激素作用的雜環(huán)多酚類化合物，廣泛存在于多種物質(zhì)中，如蔬菜、豆類、水果等，尤其是亞麻籽、三葉草及豆制品中。植物性雌激素主要包括異黃酮、香豆雌酚和木脂素三大類。植物雌激素具有抗增生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種生物活性[1-3]，故其在性激素依賴性腫瘤的防治方面?zhèn)涫荜P(guān)注[4]。黃豆苷元是具有較強(qiáng)雌激素活性的植物激素，能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、股動(dòng)脈，增強(qiáng)腦血流量和四肢血液循環(huán)，減弱血管阻力，降低血液黏度，減少心肌耗氧量，改善心功能，增加末梢血流量，改變血液流變學(xué)，并具有改善心律及降壓作用，臨床多用于高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（簡(jiǎn)稱冠心?。?、腦血栓、突發(fā)性耳聾、眩暈癥等的輔助治療，也可用于婦女更年期綜合征的治療。氯沙坦是選擇性血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，臨床廣泛用于高血壓和心力衰竭的治療[5]。氯沙坦在體內(nèi)主要由CYP2C9 代謝為羧酸代謝產(chǎn)物E-3174，二者共同作用可阻斷血管緊張素Ⅱ的生理作用，從而發(fā)揮降壓作用[6]。CYP2C9*2 和CYP2C9*3 可降低白種人體內(nèi)氯沙坦的代謝水平[7]，故攜帶CYP2C9 突變等位基因的個(gè)體可能會(huì)出現(xiàn)代謝減慢或降低，從而發(fā)生藥物中毒或降低藥物療效。在中國(guó)人群中，除了野生型CYP2C9*1，已發(fā)現(xiàn)的最主要的基因型為CYP2C9*3，頻率約為3.3% 。本研究中探討了黃豆苷元對(duì)不同CYP2C9 基因型健康受試者氯沙坦及其代謝產(chǎn)物E-3174 藥代動(dòng)力學(xué)的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與研究對(duì)象

1.1 儀器

T1 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（德國(guó)Biometra 公司）；QuattroMicro API 型串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，包括Waters 2695 型高效液相色譜儀、溫控自動(dòng)進(jìn)樣器、溫控柱溫箱、電噴霧離子化源（ESI）及MassLynx 4.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司）；KL512 型氮吹儀（北京康林科技有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

黃豆苷元片（河南中孚藥業(yè)有限公司，批號(hào)為151209）；氯沙坦片（浙江杭州默沙東藥業(yè)有限公司，批號(hào)為T034534）；氯沙坦鉀對(duì)照品（批號(hào)為100597-201703，純 度 為99.7% ），E-3174 對(duì) 照 品（批 號(hào) 為2001116，純度為99.5%），均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；引物（上海博亞生物技術(shù)有限公司）；DNA marker、內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、LA Taq 酶、dNTP（寶生物工程＜大連＞有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，華美生物工程有限公司）；普通瓊脂糖（美國(guó)Bio-Rad 公司）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為重蒸水。

1.3 研究對(duì)象

將醫(yī)院數(shù)據(jù)庫(kù)中200 名健康志愿者以限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）法進(jìn)行CYP2C9基因分型。選取志愿者前臂外周靜脈取外周血，離心、分離血漿，抽提DNA，分離不同長(zhǎng)度DNA 片段。

CYP2C9*3 基 因 分 型：上 游5′-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3′，下游5′-ACAAACTTACCTTGGGAATGAGA-3′；反應(yīng)總體積為25 μL。PCR 條件，98 ℃預(yù)變性30 s，96 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，78 ℃延伸30 s，循環(huán)34 次；74 ℃10 min，4 ℃5 min 終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL 與10 mol/L Buffer 2 μL 及Kpn 內(nèi)切酶1 μL混合，37 ℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳觀察DNA 片段。

CYP2C9*13 基 因 分 型：上 游5′-TACAAATACAATGAAAATATCA-3′ ，下 游 5′-CTAACAACCAGACTCATAATG-3′，反應(yīng)總體積為25 μL。PCR 條件，96 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)34 次；延伸70 ℃10 min，4 ℃5 min 終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL 與10 mol/L NEB 2 μL、10×BSA 0.2 μL、BstnⅠ內(nèi)切酶混合，37 ℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳觀察DNA 片段。

篩選出18 例男性受試者（對(duì)照組和試驗(yàn)組），包括CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3 與CYP2C9*1/*13基因型各6 例（3 個(gè)亞組），年齡（20.5±1.9）歲，身高（165.3±2.6）cm，體質(zhì)量（56.6±5.9）kg；身體健康，既往無(wú)肝腎疾病、出血性疾病、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病史；無(wú)藥物過(guò)敏史，無(wú)吸煙、飲酒史。本試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備及血漿樣品提取、處理

對(duì)照品溶液制備：1）氯沙坦對(duì)照品溶液。取氯沙坦鉀對(duì)照品5.91 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇-水（50 ∶50，V/ V）溶解定容，得217 μg/mL 氯沙坦對(duì)照品貯備液；用空白血漿稀釋成氯沙坦質(zhì)量濃度為1085，543，217，109，54，22，11，5，2.2，1.1，0.5 ng/mL的系列對(duì)照品溶液。2）E-3174 對(duì)照品溶液。稱取5.0 mg E-3174 對(duì)照品，置25 mL 容量瓶中，加甲醇-水（50 ∶50，V/ V）溶解定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為200 μg/mL 的E-3174 貯備液；用空白血漿稀釋成E-3174 質(zhì)量濃度為1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5 ng/mL 的系列對(duì)照品溶液。均置4 ℃貯藏，備用。

血漿樣品提?。罕驹囼?yàn)按雙周期、自身前后對(duì)照方案進(jìn)行，第一階段隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，受試者分別口服黃豆苷元片或安慰劑15 d，第15 天兩組受試者均口服氯沙坦50 mg；經(jīng)過(guò)14 d 洗脫期后交叉重復(fù)試驗(yàn)。均分別于口服氯沙坦后0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12 h 時(shí)采集靜脈血5 mL，置含乙二胺四乙酸（EDTA）的玻璃試管中，-20 ℃貯藏，備用。

血漿樣品處理：取200 μL 血漿樣品，置15 mL 玻璃離心管中，加入250 μL 0.5%甲酸溶液，混勻，加入2 mL 甲基叔丁基醚（MTBE），渦旋振蕩3 min，4000 r/min離心12 min，-40 ℃冷凍35 min，取上清液1.5 mL，置另一離心管中；40 ℃下、水浴氮?dú)鈸]干，加入200 μL 流動(dòng)相，振蕩，溶解，即得。

2.2 血藥濃度測(cè)定方法建立

色譜條件：色譜柱為ThermoHypurity C18柱（150mm×2.1 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液（60 ∶40，V/ V），流速為0.2 mL/min，柱溫為41 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣瓶溫為20 ℃。

質(zhì)譜條件：采用ESI 正離子多反應(yīng)模式檢測(cè)，正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)，全掃描模式，毛細(xì)管電壓為3.6 kV，取樣錐孔電壓30V，萃取錐孔電壓3V，ESI 源溫為100℃，去溶劑溫度為350 ℃，錐孔氣體流速為50 L/h，去溶劑氣體流速為350 L/h。氯沙坦檢測(cè)離子為m/ z423.2→m/ z405.1，207.1，192.1，氬氣碰撞能量分別為10，20，25 eV；E-3174 檢測(cè)離子為m/ z437.1→m/ z235.2，207.2，氬氣碰撞能量分別為20，25 eV。

適用性試驗(yàn)：按選定試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄質(zhì)譜。結(jié)果氯沙坦和E-3174 的保留時(shí)間分別為2.45 min 和2.78 min，各峰峰形對(duì)稱，血漿中雜質(zhì)在與氯沙坦和E-3174 對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，詳見(jiàn)圖1。氯沙坦和E-3174 最低檢出濃度分別為1.5，2.5 ng/mL。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.1 項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液，按選定試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子響應(yīng)強(qiáng)度。以氯沙坦、E-3174 質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、離子響應(yīng)強(qiáng)度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得氯沙坦、E-3174 回歸方程分別為Y氯=0.0874641X氯+0.0852054，YE=0.0271464XE+0.0637231（r均為0.9999）。結(jié)果表明，氯沙坦、E- 3174 質(zhì)量濃度分別在2.2 ～1085.0 ng/mL，2.0 ～1000.0 ng/mL 范圍內(nèi)與離子響應(yīng)強(qiáng)度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下氯沙坦、E-3174 對(duì)照品溶液適量，按選定試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄離子響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果氯沙坦、E-3174 離子響應(yīng)強(qiáng)度的RSD均小于15%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1 項(xiàng)下血漿樣品溶液適量，反復(fù)凍融，按選定試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄離子響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果5，54，543 ng/mL 氯沙坦和5，50，500 ng/mL E-3174 離子響應(yīng)強(qiáng)度的RSD均低于15%。于-40 ℃下放置30 d，按選定試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄離子響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果RSD分別在6.8% ～13.6% 和7.2% ～12.9%范圍內(nèi)，均符合化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則要求。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的血漿樣品適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的氯沙坦、E-3174 對(duì)照品溶液，同法制備血漿樣品溶液，再按選定試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子響應(yīng)強(qiáng)度，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜質(zhì)譜圖A.Blank plasma B.Blank plasma+losartan control C.Blank plasma+E-3174 control D.Losartan in plasma samples after administration E.E-3174 in plasma samples after administrationFig.1 HPLC-MS chromatograms

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)分析

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用非房室模型分析，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）法檢測(cè)氯沙坦血藥濃度，測(cè)定血漿濃度和達(dá)峰時(shí)間；采用梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積（AUC），得峰濃度（Cmax）和達(dá)峰時(shí)間（tmax）；將對(duì)數(shù)化（自然對(duì)數(shù)）的濃度-時(shí)間曲線消除相各點(diǎn)按最小二乘法原理進(jìn)行線性回歸，得直線的斜率即為清除率常數(shù)（Ke），清除半衰期（t1/2）按公式t1/2=0.693/Ke計(jì)算。采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以表示，行one-way ANOVA 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組中，與CYP2C9*1/*1 亞組比較，CYP2C9*1/*3 亞組和CYP2C9*1/*13 亞組受試者血漿E-3174 的Cmax顯著降低（P＜0.05）；試驗(yàn)組中，3 亞組受試者血漿E-3174 的Cmax無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組和對(duì)照組3 個(gè)亞組受試者血漿氯沙坦的Cmax無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組CYP2C9*1/*1基因型受試者血漿E-3174 的Cmax顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2、圖2、圖3 和表3。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2 兩組受試者血漿樣品中氯沙坦藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of pharmacokinetic parameters of losartan in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

表2 兩組受試者血漿樣品中氯沙坦藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of pharmacokinetic parameters of losartan in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

指標(biāo)AUC0→12（ng·h/mL）Cmax（ng/mL）tmax（h）t1/2（h）基因型CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13試驗(yàn)組399.88±167.00499.00±308.14600.99±302.14198.04±121.89191.60±132.55288.04±100.872.17±1.662.37±0.631.57±0.891.81±6.962.69±2.872.07±0.98對(duì)照組387.00±177.00489.00±132.00576.00±149.00187.00±58.00198.00±64.35301.00±104.002.08±0.411.98±0.561.67±0.691.65±0.602.30±0.701.78±0.80

圖2 受試者氯沙坦血藥濃度曲線A. CYP2C9*1 /*13 genotype B.CYP2C9*1 /*1 genotype C.CYP2C9*1 /*3 genotypeFig.2 The plasma concentration curve of losartan of volunteers

圖3 受試者E-3174 血藥濃度曲線A.CYP2C9*1 /*13 genotype B.CYP2C9*1 /*1 genotype C. CYP2C9*1 /*3 genotypeFig.3 The plasma concentration curve of E-3174 of volunteers

3 討論

大豆類和大豆類植物性雌激素對(duì)人體健康的影響正逐漸受到關(guān)注[8]。黃豆苷元是大豆中的主要異黃酮類物質(zhì)，可通過(guò)影響細(xì)胞凋亡或死亡、細(xì)胞周期、血管形成等發(fā)揮抗腫瘤作用[4，9]。黃豆苷和槲皮素均為大豆異黃酮，槲皮素可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性，誘導(dǎo)CYP3A 的代謝活性，其誘導(dǎo)作用呈基因多態(tài)性[10]。黃豆苷元可顯著影響健康受試者血漿他林洛爾代謝，且他林洛爾的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)不受MDR1 第3435 位基因型影響[11]。槲皮素和黃豆苷元對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體及細(xì)胞色素代謝酶的影響作用提示它們對(duì)其他經(jīng)細(xì)胞色素代謝酶代謝的藥物體內(nèi)存在相互作用。

表3 兩組受試者血漿樣品中E-3174 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of pharmacokinetic parameters of E-3174 in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

表3 兩組受試者血漿樣品中E-3174 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of pharmacokinetic parameters of E-3174 in plasma samples of volunteers in the two groups（±s，n=6）

注：與CYP2C9*1/*1 基因型比較，*P＜0.05。Note：Compared with CYP2C9*1 /*1 genotype，*P ＜0.05.

指標(biāo)AUC0-12 h（ng·h/mL）Cmax（ng/mL）tmax（h）t1/2（h）基因型CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13 CYP2C9*1/*1 CYP2C9*1/*3 CYP2C9*1/*13試驗(yàn)組2171.1±400.281779.2±308.141871.1±302.14398.04±121.89291.60±132.55*279.04±100.87*4.17±1.663.67±0.634.57±0.893.81±6.964.69±2.875.07±0.98對(duì)照組2514.00±789.001868.00±736.001832.00±644.00437.00±110.00332.00±136.00*320.00±88.00*4.08±0.413.33±0.564.28±0.693.70±1.105.02±0.905.30±1.70

氯沙坦屬血管緊張素Ⅱ1 型（AT1）受體拮抗劑，臨床廣泛用于高血壓的治療，其主要活性代謝產(chǎn)物E-3174 的活性強(qiáng)于母藥。CYP2C9 是氯沙坦代謝中的主要細(xì)胞色素代謝P450 酶，在人體內(nèi)具有高度基因多態(tài)性，至今已發(fā)現(xiàn)30 種突變等位基因[12]。CYP2C9 在中國(guó)人群中的突變等位基因型主要為CYP2C9*1/*3 和CYP2C9*1/*13 兩種[13]。這兩種基因可降低E-3174 的Cmax，但對(duì)氯沙坦的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)顯著影響。體內(nèi)約有13.6%的氯沙坦代謝成E-3174。有研究報(bào)道，連續(xù)口服細(xì)胞色素氧化酶誘導(dǎo)劑利福平7 d 后，再口服氯沙坦50 mg，可使氯沙坦和E-3174的AUC分別降低35%和40%[14]。同時(shí)，體外研究也表明，利福平對(duì)原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞模型上的CYP2C9 和CYP3A4 酶有更強(qiáng)的誘導(dǎo)活性[15]。

本研究中，兩組受試者均完成試驗(yàn)，無(wú)藥品不良反應(yīng)/事件發(fā)生。試驗(yàn)組中，與CYP2C9*1/*1 亞組比較，CYP2C9*1/*3 亞組和CYP2C9*1/*13 亞組受試者血漿E-3174 的Cmax均顯著降低；對(duì)照組3 個(gè)亞組受試者血漿E-3174 的Cmax無(wú)顯著差異；試驗(yàn)組和對(duì)照組3 個(gè)亞組受試者血漿氯沙坦的Cmax無(wú)顯著差異；與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組CYP2C9*1/*1 基因型受試者血漿E-3174 的Cmax顯著降低。

綜上所述，黃豆苷元對(duì)CYP2C9*1/*1 正?；蛐徒】凳茉囌呗壬程沟拇x無(wú)顯著影響；對(duì)于CYP2C9*1/*3及其*13 突變等位基因型健康受試者，可影響氯沙坦代謝生成E-3174，從而降低E-3174 的血藥濃度，其臨床意義有待進(jìn)一步證實(shí)。