韋玉梅，張文倩，朱閃閃，李 楊，雷勇輝，孫燕飛*

（1.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學農學院，新疆 石河子 832003）

果蔬酵素是以水果和蔬菜為原料，經過酵母菌、乳酸菌等多種有益菌發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分食用的酵素產品[1-2]。酵母菌的營養(yǎng)價值很高，含有較多的蛋白質、B族維生素和礦物質，其在酵素發(fā)酵過程中不僅能夠改善原料基質原有的一些不良風味，而且可以產生一些酚酸、抗氧化物質和次生代謝產物等有益成分，以增加酵素產品的功能性[3-4]。近年來，為了提高發(fā)酵效率，從果蔬自然發(fā)酵液中分離優(yōu)勢菌種成為了研究熱點。

優(yōu)勢菌株的獲取手段主要為自然篩選、誘變育種、紫外線誘變、自然馴化和基因工程育種[5]。其中自然篩選法最常用，因為篩選環(huán)境與酵素發(fā)酵的環(huán)境類似，篩選出的酵母菌往往性能較好，符合發(fā)酵的一些特性[6]。劉貞等[7]從傳統(tǒng)發(fā)酵的米糕中篩選出具有高發(fā)酵性能的1株酵母菌和1株乳酸菌；管慶林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，從番茄發(fā)酵液中分離的3株庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）中，菌株TY-1和TY-3對葡萄糖和酒精具有一定的耐受性，且這些菌株對番茄酵素的口感和質量提升有重要的作用；沙如意等[9]從葡萄酵素、青梅酵素、火龍果酵素中分離到3種優(yōu)勢酵母菌，且均具有耐低pH和耐高糖特性；肖夢月等[10]從自然發(fā)酵拐棗果蔬酵素中篩選出1株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），并將其應用于拐棗復合酵素，結果表明，該菌株可以去除拐棗的澀味，增加其酸甜感，提高多酚和黃酮類物質含量。

天然果蔬酵素優(yōu)勢菌株的篩選對于發(fā)酵工藝優(yōu)化、功能成分代謝和產品質量等方面具有重要意義。因此，本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離技術從自然發(fā)酵的果蔬酵素中分離酵母菌，通過高糖、乙醇耐受性研究從中篩選優(yōu)良酵母菌，通過形態(tài)觀察、生理生化及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并對其低pH、高糖、乙醇和溫度耐受性進行分析，為酵素發(fā)酵過程的探索和工業(yè)生產提供高質量的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮無病害且果實飽滿、色澤均勻的土豆、豆芽、香蕉和胡蘿卜：石河子市金馬市場；白砂糖（食品級）：南寧市碧盈食品廠。

1.1.2 試劑

Tris-HCl（1 mol/L）：上海申能博彩生物科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Tris平衡酚（純度98%）、蛋白酶K（33.5 U/mg）：德國默克公司；氯仿（純度99%）：天津市化學試劑廠；異戊醇（純度98.5%）：天津市化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：美國sigma公司；NaCl（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：天根生物化學科技有限公司；引物ITS1、ITS4：上海生工生物技術有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：北京欣興唐生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基[11]：將土豆去皮切塊，稱取200 g煮10～20 min，用干凈紗布過濾，隨后加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[12]：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水定容至1 L，pH 6.0。固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂粉。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[13]：葡萄糖50 g，瓊脂20 g，酵母浸粉4 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀0.55 g，氯化鉀0.425 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鈣0.125 g，溴甲酚綠0.022 g，氯化鐵0.002 5 g，硫酸錳0.002 5 g，蒸餾水定容至1 L，pH 6.5。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；ZHWY-100B搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；M1-L213B白色微波爐：廣東美的廚房電器制造有限公司；V8旋渦混勻器：美國Essenscien公司；SMZ800N體視顯微鏡：尼康映像儀器銷售（中國）有限公司；Imager.M2熒光顯微鏡：卡爾·蔡司股份公司；ProFlexTM3×32-well PCP System儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 果蔬酵素的制備

采用新鮮土豆、豆芽、香蕉、胡蘿卜為原料，果蔬、白砂糖、水按質量比3∶1∶10混合后置于1 000 mL已滅菌的玻璃瓶中，室溫發(fā)酵28 d，每天早晚各攪拌通風一次[8，14-15]。

1.3.2 酵母菌的分離

取果蔬酵素，經10倍梯度稀釋，取稀釋度為10-3的稀釋液100 μL涂布于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)2～4 d；挑取不同形態(tài)的單菌落，在PDA培養(yǎng)基平板上劃線分離純化，重復3次，挑取單菌落進行鏡檢，將純化好的菌株放于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 優(yōu)良酵母菌的篩選

高糖耐受性：將純化好的各菌株分別接種于含不同質量濃度葡萄糖（200 g/L、350 g/L、500 g/L、650 g/L、800 g/L）、不同體積分數乙醇（6%、9%、12%、15%、18%）的YPD培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一周后觀察菌落生長情況并進行統(tǒng)計，每株菌重復接種3次，以酵母菌在YPD培養(yǎng)基上的生長情況反映其對高糖和乙醇的耐受性，篩選耐受性較好的優(yōu)良菌株。

1.3.4 酵母菌的鑒定

形態(tài)觀察：觀察分離菌株的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)特征[16]。

生理生化試驗：參考文獻[9，17-19]進行糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、最高生長溫度試驗、無維生素培養(yǎng)基上的生長試驗。

分子生物學鑒定：采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取酵母菌菌株基因組DNA[20]。利用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對酵母5.8S-ITS序列進行PCR擴增[21-22]。PCR擴增體系：DNA模板1 μL、ITS1和ITS4各1 μL、2×TaqPCR Master Mix 10 μL、雙蒸水（ddH2O）補充至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的5.8S-ITS序列，通過MEGA6.0軟件中的鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.5 優(yōu)良酵母菌的耐受性試驗

種子液的制備：將篩選得到的優(yōu)良酵母菌劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基，28 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h作為種子液，備用。

低pH耐受性：按3%（V/V）的接種量將種子液接種于pH值分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)120 h，每隔12 h 取一次樣，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標，繪制菌株的生長曲線[9，16]。

葡萄糖耐受性：將活化好的菌液按3%（V/V）的接種量，接種于葡萄糖含量分別為300 g/L、450 g/L、600 g/L、750 g/L、900 g/L的YPD液體培養(yǎng)基（pH 5.0），28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)120 h，每隔12 h取一次樣，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），繪制菌株的生長曲線。

乙醇耐受性試驗：采用杜氏管發(fā)酵法測定[7]。高壓滅菌后含有杜氏小管的試管中加入YPD液體培養(yǎng)基，再按8%、10%、12%、14%和16%的體積分數加入無水乙醇，把活化后的酵母菌接入試管內，一定時間內觀察菌株的產氣速度和產氣量。

溫度耐受性試驗：通過菌落生長觀察法測定[23]。將酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基，于不同的溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃和42 ℃）條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況。

1.3.6 數據處理

采用Excel 2016、Origin 9.0軟件進行數據處理分析，采用SPSS 25.0軟件對數據進行單因素方差分析，采用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 自然發(fā)酵果蔬酵素中酵母菌的分離純化

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離技術從自然發(fā)酵的果蔬酵素中共分離到6株酵母菌。

2.2 優(yōu)良酵母菌的篩選

2.2.1 高糖耐受性

6株酵母菌的高糖耐受性見表1。由表1可知，6株酵母菌均能在葡萄糖質量濃度為200～650 g/L的YPD培養(yǎng)基上生長。除菌株5-1-1和2-1-2外，其余菌株均能在葡萄糖質量濃度為800 g/L的YPD培養(yǎng)基上生長，且菌株7-1-1生長明顯，高糖耐受性較好。

表1 6株酵母菌的高糖耐受性試驗結果Table 1 Results of high sugar tolerance tests of 6 yeast strains

2.2.2 乙醇耐受性

6株酵母菌的乙醇耐受性見表2。由表2可知，6株酵母菌均能在含體積分數為6%的乙醇的YPD培養(yǎng)基上生長，其中，菌株7-1-1和2-4-1可以在含體積分數為12%的乙醇的YPD培養(yǎng)基上明顯生長。綜上，選擇菌株7-1-1為優(yōu)良菌株。

表2 6株酵母菌的乙醇耐受性試驗結果Table 2 Results of ethanol tolerance tests of 6 yeast strains

2.3 酵母菌7-1-1的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

菌株7-1-1的菌落及細胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌株7-1-1在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落為圓形，白色不透明，菌落扁平，表面有褶皺，邊緣不整齊，易挑起，并散發(fā)清淡的香味。光學顯微鏡下，細胞呈橢圓形，繁殖方式為單端芽殖或多端芽殖。

圖1 菌株7-1-1在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落（a）及細胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain 7-1-1 on WL medium

2.3.2 生理生化試驗

菌株7-1-1的生理生化特征見表3。由表3可知，菌株7-1-1能夠發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和棉子糖，但不能發(fā)酵乳糖和海藻糖；能夠同化葡萄糖、蔗糖、松三糖、甲基-吡喃葡萄糖、纖維二糖、水楊苷、乙醇、甘油、赤蘚糖醇、D-山梨醇、D-甘露醇、50%葡萄糖、可溶性淀粉，但不能同化L-鼠李糖、L-山梨糖、菊糖、蜜二糖、甲醇、半乳糖醇；能同化硝酸鈉和亞硝酸鈉。此外，菌株7-1-1能夠在無維生素環(huán)境下生長。對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》檢索表[17]和最新的酵母分類系統(tǒng)[18-19]，初步鑒定菌株7-1-1為威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。

表3 菌株7-1-1的生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical tests results of strain 7-1-1

續(xù)表

2.3.3 分子生物學鑒定

對菌株7-1-1的5.8S-ITS區(qū)序列進行PCR擴增，PCR擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物目的條帶清晰，堿基長度約為600 bp，與預期結果相符。

圖2 菌株7-1-1 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig. 2 Agarose electrophoresis result of PCR product of strain 7-1-1

PCR擴增產物經測序后，構建菌株7-1-1的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株7-1-1與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）（以前為Pichia anomala）聚于同一分支，親緣關系最近，因此結合形態(tài)學及生理生化，鑒定菌株7-1-1為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），該菌株的登錄號為GenBank MZ420152。

圖3 基于5.8S-ITS基因序列菌株7-1-1的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain 7-1-1 based on 5.8S-ITS gene sequences

2.4 菌株7-1-1的耐受性試驗結果

2.4.1 低pH耐受性

pH對酵母菌的生長代謝有較大影響，能影響細胞間的代謝傳遞及酶活性，在較低或較高的pH下可使酵母菌死亡[24]。不同低pH值下，菌株7-1-1的生長曲線見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的降低，菌株7-1-1的生長變緩慢。當培養(yǎng)基的初始pH為3.5時，菌株7-1-1的OD600nm值最大，生長情況最好；當培養(yǎng)基的初始pH為1.5時，菌株仍可生長，說明該菌株可耐低pH。李棒等[12]從藍莓果皮及特香型白酒酒醅中分離的一株異常威克漢遜酵母在培養(yǎng)基起始pH為2.5、3.0、3.5時可以生長；史雁飛[25]從白酒大曲及酒醅分離的一株異常威克漢遜酵母在pH為3.6時生長得最好，說明W.anomalus的生長受pH影響較小，有較強的耐酸性。相較于之前的研究報道，菌株7-1-1的耐酸性較為突出，達到了pH 1.5。

圖4 不同pH下菌株7-1-1的生長曲線Fig. 4 Growth curve of strain 7-1-1 at different pH

2.4.2 葡萄糖耐受性

添加一定濃度的糖可以為酵母菌的生長提供必需的碳源，但在較高濃度下會改變酵母菌細胞膜的滲透壓從而抑制其生長[11，26]。不同葡萄糖質量濃度下，菌株7-1-1的生長曲線見圖5。由圖5可知，葡萄糖質量濃度增加到一定值后，菌株7-1-1生長會受到抑制，其延滯期會延長。當初始葡萄糖質量濃度為300 g/L、450 g/L、600 g/L、750 g/L、900 g/L時，菌株7-1-1的延滯期分別為12 h、12 h、12 h、12 h、36 h；當初始葡萄糖質量濃度為450 g/L時，菌株7-1-1生長情況最好；當初始葡萄糖質量濃度為900 g/L時，菌株7-1-1仍能夠緩慢生長，說明該菌株7-1-1有較好的高糖耐受性。李棒等[12]研究表明，在蔗糖含量＜70%時，異常威克漢遜酵母受到的抑制較小，但當蔗糖含量＞70%時，菌株生長會隨著蔗糖濃度的升高，抑制作用逐漸增強。這可能是發(fā)酵底物不同，使得異常威克漢遜酵母對糖的耐受性不同。本試驗從自然發(fā)酵果蔬酵素中分離得到耐高糖能力達到900 g/L的異常威克漢遜酵母，這為耐高滲果蔬發(fā)酵劑的使用提供理論依據。

圖5 不同葡萄糖質量濃度下菌株7-1-1的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain 7-1-1 at different glucose mass concentration

2.4.3 乙醇耐受性

酵母菌對乙醇的耐受性會影響發(fā)酵效率[23]。菌株7-1-1對乙醇的耐受性試驗結果見表4。由表4可知，該菌株能夠在乙醇體積分數為8%、10%和12%的YPD培養(yǎng)基中生長，并且杜氏小管在48 h內充滿氣體，說明菌株7-1-1的發(fā)酵能力較強；當乙醇體積分數為14%時，菌株7-1-1仍可生長，且在48 h內杜氏小管中的氣體達到1/2，表明發(fā)酵能力有所減弱；當乙醇體積分數為16%時，菌株7-1-1在杜氏小管中只有微量氣體，說明在此條件下該菌株不適宜發(fā)酵。史雁飛等[25]研究表明，異常威克漢遜酵母可在酒精度為12%vol的條件下生長，研究中菌株7-1-1可耐受乙醇體積分數14%，說明菌株7-1-1對乙醇具有較好的耐受性，能夠在發(fā)酵中保持良好的存活率，促進改善風味，增加酵素產品的功能性，滿足果蔬酵素發(fā)酵的需求。

表4 菌株7-1-1的乙醇耐受性試驗結果Table 4 Ethanol tolerance test results of strain 7-1-1

2.4.4 溫度耐受性

溫度是影響酵母菌生長的重要因素，會影響酵母菌的酶活和對營養(yǎng)物質的吸收利用，而不同的酵母菌對溫度的耐受性也不同[8]。菌株7-1-1對溫度的耐受性試驗結果見表5。由表5可知，菌株7-1-1在25～35 ℃條件下能夠生長，在37 ℃條件下生長緩慢，在42 ℃條件下不生長。邊明鴻等[27]從發(fā)酵的桑葚果酒中篩選的異常威克漢遜酵母可以在溫度為36 ℃環(huán)境下生長；張玉然等[28]從白酒酒醅中分離的異常威克漢遜酵母在38 ℃條件下可以生長，在42 ℃高溫下生長受到強烈抑制。這與本研究結果一致。說明菌株7-1-1對溫度有較好的耐受性，可以37 ℃條件下生長，可提高在酵素發(fā)酵中酵母菌的酶活，促進產物的合成，增加酵素的產品質量。

表5 菌株7-1-1的溫度耐受性試驗結果Table 5 Temperature tolerance test results of strain 7-1-1

3 結論

本研究從自然發(fā)酵果蔬酵素中分離出一株耐高糖、乙醇的優(yōu)良酵母菌，編號為7-1-1，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定該菌株為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。該菌株能夠耐受低pH值1.5、葡萄糖質量濃度900 g/L、乙醇體積分數14%和溫度37 ℃，具有較好的耐受性，對功能微生物酵素產品的研究開發(fā)和工業(yè)化生產具有一定的意義。