王雪酈 申開衛(wèi) 雷超 邱樹毅

摘要：【目的】研究羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和纖維素粉對纖維素降解細菌篩選結(jié)果的影響，為廢棄食用菌菌渣的綜合利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā糠謩e以CMC-Na和纖維素粉為唯一碳源，采用剛果紅染色法從廢棄菌渣中篩選出具有纖維素降解性能的細菌，利用形態(tài)學和分子生物學對其進行鑒定，通過酶活力測定和濾紙崩解試驗對各菌株的纖維素降解特性進行對比分析?！窘Y(jié)果】從CMC-Na固體培養(yǎng)基分離純化獲得的34株細菌中有7株具有較好的纖維素降解性能，經(jīng)鑒定主要是芽孢桿菌（Bacillus sp.）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），而從纖維素粉固體培養(yǎng)基分離純化獲得的36株細菌中有7株具有較好的纖維素降解性能，經(jīng)鑒定主要是高山芽孢桿菌（B. altitudinis）、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus）、解淀粉芽孢桿菌、解淀粉芽胞桿菌植物亞種（B. amyloliquefaciens subsp. plantarum）、沼澤芽孢桿菌（B. vallismortis）、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）和芽孢桿菌。通過酶活力測定試驗和濾紙條崩解試驗發(fā)現(xiàn)，g31菌株在7 d內(nèi)能將濾紙崩解成糊狀，該菌株具有最高的濾紙酶（FPase）和內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）活力，分別為33.14和394.41 U/mL，而C23菌株具有較高的β-葡萄糖苷酶（β-Gase）活力，為118.12 U/mL，g29菌株具有較高的外切葡聚糖酶（Cex）活力，為1.22 U/mL?！窘Y(jié)論】以纖維素粉為碳源分離篩選得到的纖維素降解細菌種類更豐富，具有更好的濾紙崩解效果和更高的酶活性能，可為纖維素降解提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

關(guān)鍵詞： 食用菌菌渣;碳源;纖維素降解細菌;篩選;降解特性

中圖分類號： S646.099? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2913-10

收稿日期：2021-04-08

Screening and characteristics analysis of degradation of cellulose degrading bacteria from waste edible fungus residue

WANG Xue-li1，2，3， SHEN Kai-wei1，2， LEI Chao1，2， QIU Shu-yi1，2*

（1Guizhou Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy， Guiyang? 550025， China;

2College of Liquor and Food Engineering，Guizhou University， Guiyang? 550025， China;

3College of Life Science，Guizhou University，Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】To study the influence of carboxymethyl cellulose sodium（CMC-Na） and cellulose powder on the screening results of cellulose degrading bacteria， and provide a basis for the comprehensive utilization of waste edible fungus residue. 【Method】In this study，CMC-Na and cellulose powder were used as the only carbon sources， the cellulose degrading bacteria were screened from the edible mushroom slag by Congo red staining method，which were identified by morphology and molecular biology，and the cellulose degradation characteristics of each strain were compared and analyzed by enzyme vitality determination and filter paper disintegrate test. 【Result】The results showed that 34 bacteria were isolated and purified from the CMC-Na，7 of them had good cellulose degradation performance，which were mainly identified as Bacillus sp.， B. subtilis， B. amyloliquefaciens. While 36 strains were isolated and purified from the cellulose powder solid medium，7 of them had good cellulose degradation performance，there were mainly identified as B. altitudinis， B. methylotrophicus， B. amyloliquefacien， B. amyloliquefaciens subsp. plantarum， B. vallismortis， Bacillus sp. Through the enzyme activity determination test and the filter paper strip disintegration test，it was found that the g31 strain could disintegrate the filter paper into a paste within 7 d，and this strain had the highest filter paper enzyme（FPase） activityand endoglucanase （CMCase） activity，the enzyme activities reached 33.14 and 394.41 U/mL，while the C23 strain had a higher β-glucosidase （β-Gase） activity，which was 118.12 U/mL，g29 strain had a higher exo-glucanaanaose carbohydrase （Cex）activity，which was 1.22 U/mL. 【Conclusion】The study shows that the cellulose degrading bacteria isolated and screened with cellulose powder as carbon source are more abundant， have better filter paper disintegration effect and higher enzyme activity， which can provide high-quality strain resources for cellulose degradation.

Key words： waste edible fungus residue; carbon source; cellulose degrading bacteria; screening; degradation chara-cteristic

Foundation item： Guizhou Science and Technology Support Project（Qiankehezhicheng〔2020〕1Y116）， Qiankehezhicheng〔2020〕1Y154）; Guizhou Science and Technology Platform and Talent Team Planning Project（QKHPTRC〔2018〕5251）; Guizhou Fermentation Engineering and Baijiu Brewing Talent Base Project（Qianrenlingfa〔2018〕3）

0 引言

【研究意義】食用菌產(chǎn)業(yè)被納入《貴州省十大千億級工業(yè)產(chǎn)業(yè)振興行動方案》，全省食用菌種植規(guī)模從2017年10億棒增長至2019年40億棒。食用菌采摘后殘留下大量的培養(yǎng)基質(zhì)——菌渣（劉曉梅等，2015），菌渣庫存量隨食用菌產(chǎn)量的增長而劇增，現(xiàn)已成為大宗農(nóng)業(yè)固體有機廢棄物（黃武強和周紅，2019;謝光輝等，2019），如何有效利用食用菌菌渣成為食用菌產(chǎn)業(yè)中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。研究表明，食用菌菌渣中含有豐富的糖、蛋白質(zhì)和鈣、磷、鉀、鐵、鎂等營養(yǎng)物質(zhì)（李勇等，2021;劉愛紅，2021），具有非?？捎^的潛在利用價值，隨意堆放或低效應用不僅會給環(huán)境帶來負面影響，還會造成資源浪費（黃小云等，2019;王艮梅等，2019）。目前廢棄菌渣最主要的利用途徑是經(jīng)發(fā)酵制成有機肥料，但由于菌渣中含纖維素晶體結(jié)構(gòu)，受其高能氫鍵的影響導致菌渣難以被降解，帶來堆肥過程腐熟周期長、有機物利用率低等問題（周錦錦，2016;王麗萍等，2018）。為解決上述問題，有學者在堆肥過程中接種能分泌纖維素酶的外源微生物，將菌渣中難降解的纖維素、木質(zhì)素降解為寡糖、纖維二糖、葡糖糖和還原糖等物質(zhì)（張野等，2020），以加快堆肥過程中纖維素的降解，縮短堆肥時間，提高堆肥品質(zhì)（童江云等，2018;李林超等，2019）。因此，有關(guān)纖維素降解菌的分離、篩選、菌種資源庫建立及纖維素酶解機制研究已成為當前農(nóng)業(yè)資源再利用的一大熱點。【前人研究進展】目前已報道的纖維素降解菌主要有細菌、真菌和放線菌（劉曉飛等，2020;李婷等，2021;孫會剛等，2021），針對纖維素降解真菌的報道較多。卓瑪曲措等（2020）研究纖維素降解真菌SJL-2的最佳產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明外源添加碳源糊精和氮源氯化銨可增強菌株SJL-2的產(chǎn)酶能力，最佳產(chǎn)酶pH為6.5，最佳產(chǎn)酶溫度為30 ℃;曹永佳等（2021）研究添加有機營養(yǎng)、無機鹽、金屬離子和表面活性劑等對白腐真菌樹舌靈芝（Ganoderma applanatum）、毛栓孔菌（Trametes hirsuta）和木蹄層孔菌（Fomes fomentarius）漆酶、濾紙纖維素酶、木聚糖酶活性的影響，結(jié)果表明3種真菌分泌的木質(zhì)纖維素酶活性均較高，均可作為木質(zhì)纖維生物質(zhì)預處理的備選菌株，而Cu2+的添加可提高漆酶活性，表面活性劑則對3種酶活的誘導作用均十分顯著。纖維素降解細菌因發(fā)酵產(chǎn)酶時間短、發(fā)酵條件便于控制、耐受性（耐酸、耐堿）強、最適發(fā)酵溫度范圍廣等優(yōu)點具有潛在的工業(yè)化發(fā)展價值（梁倩等，2019），目前報道的纖維素降解細菌多為假單胞菌屬（Pseudomonas）（Menéndez et al.，2015）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（萬文結(jié)等，2017）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（常帆等，2018）等。不少學者開始從極端環(huán)境中篩選纖維素降解細菌，孟建宇等（2021）采用富集培養(yǎng)和純培養(yǎng)法從內(nèi)蒙古西部地區(qū)10 ℃低溫環(huán)境下分離出36株低溫纖維素降解細菌，其中以假單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）為主要的纖維素降解細菌;武肖莎等（2021）從50～70 ℃高溫堆肥環(huán)境中篩選出1株具有高效降解木質(zhì)纖維素的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtils），研究發(fā)現(xiàn)該菌具有發(fā)酵啟動快、升溫迅速、高溫持續(xù)時間長、木質(zhì)纖維素降解充分等優(yōu)勢。實際上微生物降解纖維素的能力不僅與酶自身特性有關(guān)，還與培養(yǎng)基成分有關(guān)（黃春凱等，2015）。張晶等（2007）發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的組成對篩菌結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響;唐玉佳等（2021）篩選出 1株高纖維素酶活性菌株弗村假單胞菌（Pseudomonas vranovensis）N32，對菌株N32的酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)當pH為4.0、搖床速度為140 r/min、培養(yǎng)溫度為30 ℃、裝液量為125 mL時酶活力最強;鐘斌等（2021）從沼渣堆肥中分離出1株纖維素降解菌產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis Strain）F3，并對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)時間和接種量分別取35 ℃、7.0、3 d和2%時羧甲基纖維素酶和濾紙酶活性達最高，分別為2.63和2.23 U/mL?！颈狙芯壳腥朦c】目前，在纖維素降解菌的研究中常用碳源主要有羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（王海濱等，2015;王偉等，2019）、纖維素粉（劉最等，2018;王天生等，2018）和微晶纖維素（孟建宇等，2019，2020），而有關(guān)CMC-Na和纖維素粉對纖維素降解細菌篩選結(jié)果的影響研究尚未見文獻報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以廢棄食用菌菌渣為研究對象，研究CMC-Na和纖維素粉對纖維素降解菌篩選結(jié)果的影響，為廢棄食用菌菌渣的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 樣品來源及主要試劑 菌渣取自貴州省某食用菌生產(chǎn)基地。細菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;CMC-Na、硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈣、無水磷酸二氫鉀、三氯化鐵、冰乙酸、剛果紅、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉和偏重亞硫酸鈉等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;纖維素粉、純化瓊脂粉、蛋白胨和酵母粉等試劑均為生化試劑，購自上海博微生物科技有限公司。

1. 1. 2 主要培養(yǎng)基 CMC-Na固體培養(yǎng)基：CMC-Na 15.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4 0.2 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL，pH自然（張夢君等，2019）。

纖維素粉固體培養(yǎng)基：纖維素粉15.0 g，其他成分同上述CMC-Na固體培養(yǎng)基。

濾紙條崩解培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO3 2.5 g，CaCl2·6H2O 0.1 g，蒸餾水1000 mL。濾紙條規(guī)格為2 cm×1.5 cm，使用前參照王偉等（2019）的方法對濾紙進行預處理。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：參照雅男（2017）的培養(yǎng)基配方，去掉瓊脂后即得牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，CaCl2 0.3 g，MgSO4 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4 0.0016 g，ZnSO4·7H2O 0.0012 g，COCl2 0.002 g，蛋白胨5.0 g，碳源對應選用CMC-Na（纖維素粉）5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均置于121 ℃下滅菌20 min。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 纖維素降解細菌分離和純化 稱取菌渣25 g，置于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，于30 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)30 min（120 r/min），制得10-1濃度梯度。選擇10-4、10-5和10-6 3個濃度梯度，分別取100 μL涂布于CMC-Na固體培養(yǎng)基和纖維素粉固體培養(yǎng)基上，每個濃度梯度重復3次。將涂布好的培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑選出不同菌落形態(tài)的菌株再次進行劃線培養(yǎng)，直至出現(xiàn)純的單菌落為止，將純化后的單菌株接種于保藏培養(yǎng)基，置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 纖維素降解細菌篩選 將分離純化后的菌株分別接種至CMC-Na固體培養(yǎng)基和纖維素粉固體培養(yǎng)基中，每株菌株在同一培養(yǎng)皿中點接3次，將其置于30 ℃下培養(yǎng)3 d后取出進行剛果紅染色，染色過程參照王翀等（2019）的操作，測量并計算透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值，選擇D/d值較大的菌株進行后續(xù)研究。

1. 2. 3 纖維素降解細菌鑒定

1. 2. 3. 1 形態(tài)學鑒定 將菌株點接在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d，觀察并記錄單菌落的形態(tài)特征。同時，挑取少量菌落制成載玻片進行革蘭氏染色，利用奧尼巴斯CX31顯微鏡觀察其細胞形態(tài)。

1. 2. 3. 2 分子生物學鑒定 將菌株接種到裝有已滅菌的50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，采用通用上游引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和下游引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對纖維素降解細菌進行PCR擴增。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果拼接后輸入NCBI數(shù)據(jù)庫，通過BLAST進行同源比對分析，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 4 酶活力測定試驗

1. 2. 4. 1 粗酶液制備 將菌株接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，置于30 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液離心（12000 r/min，10 min）后的上清液即為粗酶液。

1. 2. 4. 2 葡萄糖標準曲線繪制 向具塞試管中分別加入1 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL后，加蒸餾水至總體積為2.0 mL，向各試管中加入2.0 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，在波長540 nm處測定各試管中的OD值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標、OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，擬合得到回歸直線方程：y=0.3029x-0.0153，R2=0.9949。

1. 2. 4. 3 酶活力測定與計算 參照Miller（1959）、劉曉梅（2015）的方法，對菌株的濾紙酶（FPase）、外切葡聚糖酶（Cex）、內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）及β-葡萄糖苷酶（β-Gase）進行活力測定。

1. 2. 5 纖維素降解細菌的濾紙條崩解試驗 將菌株接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后制成種子懸浮液，經(jīng)鏡檢菌種量約為5×108 CFU/mL。將種子懸浮液按1%的接種量接入濾紙條崩解培養(yǎng)基中，置于30 ℃、120 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)10 d，同時以1%的無菌水代替種子懸浮液接入相同培養(yǎng)基中作為對照，每菌株重復3次作為平行，定期觀察并記錄濾紙的崩解情況（吳慶珊，2018）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 纖維素降解細菌的分離篩選結(jié)果

分別以CMC-Na和纖維素粉為唯一碳源，從廢棄菌渣中分離純化出70株纖維素降解細菌，其中CMC-Na固體培養(yǎng)基中有34株，命名為C1～C34;纖維素粉固體培養(yǎng)基中有36株，命名為g1～g36。將上述菌株分別點接到對應固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后經(jīng)剛果紅染色試驗觀察透明圈大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有45株菌株出現(xiàn)明顯的透明圈，其中CMC-Na培養(yǎng)基中有16株，纖維素粉培養(yǎng)基中有29株。部分菌株的剛果紅透明圈如圖1所示，各菌株透明圈直徑（D）、菌落直徑（d）及其D/d值如表1所示。由表1可知，CMC-Na培養(yǎng)基中透明圈D/d值小于3.00的菌株占所篩菌株總數(shù)的56%，而纖維素粉培養(yǎng)基中透明圈D/d值小于3.00的菌株占所篩菌株總數(shù)的76%。CMC-Na培養(yǎng)基中透明圈D/d值平均為3.04，最大D/d值為5.26;而纖維素粉培養(yǎng)基中D/d值平均為2.66，最大D/d值達7.87，表明不同菌株之間降解纖維素的能力有所區(qū)別。

2. 2 纖維素降解細菌的鑒定結(jié)果

2. 2. 1 形態(tài)學鑒定結(jié)果 選擇D/d值≥3.00的纖維素降解細菌共14株，置于30 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，記錄各菌株的形態(tài)特征，挑取少量菌落進行革蘭氏染色。單菌落形態(tài)特征描述如表2所示，所有菌株革蘭氏染色結(jié)果均顯陽性。

2. 2. 2 分子生物學鑒定 將篩選的14株纖維素降解細菌PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，把測序所得序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，當16S rDNA序列相似性超過97%時即可認定為屬內(nèi)同種（韓夢穎等，2017;程鵬等，2019），具體比對結(jié)果如表3所示。由表3可知，從CMC-Na固體培養(yǎng)基中篩選出的菌株主要包括芽孢桿菌（Bacillus sp.）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），而從纖維素粉固體培養(yǎng)基中篩選出的菌株主要有高山芽孢桿菌（B. altitudinis）、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus）、解淀粉芽孢桿菌、解淀粉芽胞桿菌植物亞種（B. amyloli-quefaciens subsp. plantarum）、沼澤芽孢桿菌（B. vallismortis）、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）和芽孢桿菌。

2. 3 酶活力測定結(jié)果

將篩選出的14株菌株進行產(chǎn)酶試驗，對各菌株的粗酶液進行FPase、Cex、CMCase和β-Gase活力測定，結(jié)果見表4。從CMC-Na固體培養(yǎng)基篩選的7株菌株中，C17菌株的FPase酶活力高于其他菌株，C2菌株的CMCase酶活力高于其他菌株，C23菌株的Cex和β-Gase酶活力高于其他菌株;所篩菌株的FPase、CMCase、Cex和β-Gase酶活力平均值分別為22.00、200.88、0.54和68.63 U/mL。從纖維素粉固體培養(yǎng)基篩選的7株菌株中，g31菌株的FPase、CMCase和β-Gase酶活力均高于其他菌株，g29菌株的Cex酶活力高于其他菌株;所篩菌株的FPase、CMCase、Cex和β-Gase酶活力平均值分別為25.50、281.44、0.70和74.42 U/mL。對比表4中各菌株的酶活力和表1中各菌株的剛果紅透明圈D/d值，研究發(fā)現(xiàn)剛果紅透明圈的大小與酶活力之間并無明顯相關(guān)性。

2. 4 濾紙條崩解試驗結(jié)果

選擇D/d值≥3.00的纖維素降解細菌共14株置于濾紙條崩解培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，濾紙的崩解效果如表5所示。以CMC-Na為碳源篩選的7株菌株中，C2、C14和C23 3株菌株對濾紙的降解效果較明顯，濾紙出現(xiàn)糊狀，但并未完全崩解，C17菌株處理后的濾紙僅出現(xiàn)彎曲，而C3、C9和C16 3株菌株對濾紙的降解作用較小，濾紙邊緣因變毛而出現(xiàn)不完整。以纖維素粉為碳源篩選的7株菌株中，g31菌株對濾紙的降解效果最好，濾紙在第7 d已完全崩解成糊狀，g19和g25 2株菌株處理后的濾紙出現(xiàn)糊狀，但并未完全崩解，g7、g24和g29 3株菌株處理后的濾紙僅出現(xiàn)彎曲，并未出現(xiàn)明顯降解，而g27菌株對濾紙的降解作用較小，濾紙邊緣因變毛而出現(xiàn)不完整。

3 討論

本研究分別以CMC-Na和纖維素粉為碳源從廢棄食用菌菌渣中篩選纖維素降解細菌，結(jié)果表明利用纖維素粉為碳源時篩選出的纖維素降解細菌種類更多，濾紙崩解試驗更明顯，酶活力更高。主要是因為CMC-Na在弱酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，常以沉淀形式存在，從而影響了纖維素降解菌對碳源的利用，導致菌株纖維素降解能力較低。

本研究所篩菌株在屬水平上均隸屬于芽孢桿菌屬，與薛藩（2019）、毛婷等（2020）的研究結(jié)果一致，芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶系中內(nèi)切纖維素酶活性相對其他菌株較高，因其在不利的條件下可形成芽孢，能適應高溫、酸堿環(huán)境。但從種水平上來說，以CMC-Na為碳源篩選的纖維素降解細菌種類較少，只有枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，而以纖維素粉為碳源篩選出的纖維素降解細菌主要有高山芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、解淀粉芽胞桿菌植物亞種、沼澤芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌，研究結(jié)果表明以纖維素粉為碳源分離篩選得到的纖維素降解細菌種類更豐富。鄭麗等（2017）從木薯生境中篩選出酶活力較高的解淀粉芽孢桿菌，岳丹等（2018）從土壤中篩選出具有高效降解纖維素性能的枯草芽胞桿菌，梁倩等（2019）從涼茶中藥渣堆肥和黑龍江玉米地土壤中篩選出纖維素酶高產(chǎn)菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。本研究首次報道了高山芽孢桿菌和沼澤芽孢桿菌具有較好的纖維素降解能力。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)剛果紅透明圈D/d值與纖維素酶活力以及纖維素降解能力的強弱并非呈正相關(guān)，與程鵬等（2019）的研究結(jié)果不一致。以往纖維素降解菌的篩選多依賴剛果紅染色法，但于慧娟和郭夏麗（2019）提出該方法容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，因此高效纖維素降解菌的篩選還得以酶活力的定量測定為依據(jù)。本研究所篩纖維素降解細菌相比目前已報道的纖維素降解菌而言，具有較高的纖維素酶活，C14菌株枯草芽孢桿菌的CMCase酶活力高達250.99 U/mL，明顯高于陳麗燕等（2011）篩選的CM2菌株產(chǎn)生的167.17 U/mL和王偉等（2019）篩選的YDL3菌株產(chǎn)生的26.87 U/mL，g31菌株貝萊斯芽孢桿菌的CMCase酶活力高達394.41 U/mL，明顯高于童江云等（2018）篩選的DCB2菌株產(chǎn)生的2.29 U/mL。

針對各菌株相關(guān)酶活力的研究還發(fā)現(xiàn)酶活力不僅在不同種菌株間有所差別，即使在同一種菌株間也存在明顯差異。從CMC-Na固體培養(yǎng)基中篩選出的C9、C16、C17和C23等4株菌株經(jīng)鑒定均為解淀粉芽孢桿菌，但其同一酶活也存在明顯差異，與張悅（2019）研究發(fā)現(xiàn)2株菌株酶活有差異的結(jié)果一致。王麗萍等（2018）提出同一菌株不同酶活性的差異反映出菌株對纖維素的降解機理和作用方式的特性。研究后續(xù)利用濾紙崩解試驗對各菌株的纖維素降解性能進行驗證，發(fā)現(xiàn)所篩菌株均對濾紙條產(chǎn)生不同程度的崩解效應，且濾紙條的崩解效果與酶活力尤其是CMCase酶活力呈正相關(guān)。本研究不僅為纖維素降解提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源，也為食用菌菌渣的綜合利用提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)，后續(xù)將開展復合菌株的纖維素降解性能研究，探索菌株間的協(xié)同作用機制。

4 結(jié)論

以纖維素粉為碳源分離篩選得到的菌株種類更豐富，具有更好的濾紙崩解效果和更高的酶活性能;剛果紅透明圈D/d值與纖維素酶活力及纖維素降解能力并非呈正相關(guān)。本研究可為纖維素降解提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

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基金項目：貴州省科技支撐項目（黔科合支撐〔2020〕1Y116），黔科合支撐〔2020〕1Y154）;貴州省科技平臺及人才團隊計劃項目（黔科合平臺人才〔2018〕5251）;貴州省發(fā)酵工程與白酒釀造人才基地項目（黔人領(lǐng)發(fā)〔2018〕3號）

通訊作者：邱樹毅（1963-），https：//orcid.org/0000-0002-9290-1660，博士，教授，主要從事發(fā)酵工程研究工作，E-mail：syqiu@gzu.edu.cn

作者簡介：王雪酈（1986-），https：//orcid.org/0000-0003-0622-813X，博士，高級實驗師，主要從事應用生物技術(shù)研究工作，E-mail：xlwang2@gzu.edu.cn

王雪酈（1986-），博士，高級實驗師，主要從事應用生物技術(shù)研究工作。主持或作為主要成員參與國家重點研發(fā)項目“喀斯特山區(qū)農(nóng)村飲用水消毒與污水處理關(guān)鍵技術(shù)”、國家自然科學基金項目“基于適配體的納米催化調(diào)控劑其對食品農(nóng)藥殘留檢測新方法研究”“葡萄酒發(fā)酵過程中標識Hansenisapora菌群活力關(guān)鍵靶標分子篩選及細胞死亡過程解析”及貴州省科技支撐項目“貴州喀斯特地區(qū)農(nóng)村飲用水細菌/病原菌快速檢測及殺滅技術(shù)的研發(fā)”“貴州食用菌廢棄菌棒肥料化高效利用關(guān)鍵技術(shù)研究及應用”等科研項目20余項。獲貴州省科技進步獎二等獎1項，申請國家發(fā)明專利26項，授權(quán)實用新型專利4項，參與制定團體標準2項;在《Food Chemistry》《Microchimica Acta》《南方農(nóng)業(yè)學報》等國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文17篇。