舒健虹 王子苑 劉曉霞 王小利

摘要：【目的】克隆高羊茅藍(lán)光受體家族基因（FaFKF1），分析其序列特征及亞細(xì)胞定位，并檢測其在不同光照處理下的節(jié)律表達(dá)特征，為探索其在成花中的調(diào)控機(jī)制及高羊茅光周期適應(yīng)性育種提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦ACE方法克隆FaFKF1基因cDNA全長序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞，觀察熒光信號以確定蛋白亞細(xì)胞定位情況。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FaFKF1基因不同光照處理和不同生長階段的節(jié)律表達(dá)特征?！窘Y(jié)果】克隆獲得FaFKF1基因cDNA全長為2266 bp，開放閱讀框（ORF）為1881 bp，編碼626個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為68.89 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.76，脂肪系數(shù)為80.99，不穩(wěn)定指數(shù)為39.81，屬于較穩(wěn)定的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。FaFKF1蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋（24.92%），無規(guī)則卷曲（44.89%）、延伸鏈（23.16%）和β-轉(zhuǎn)角（7.03%）。FaFKF1蛋白與大豆（NP_001235886.2）、大麥（KAE8795993.1）和二穗短柄草（XP_003577479.1）的氨基酸序列相似性較高，為79.50%～87.68%，且與二穗短柄草FKF1蛋白的親緣關(guān)系最近，其次是大麥和小麥。長日照處理下，F(xiàn)aFKF1基因在苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期的葉片中均有表達(dá)，相對表達(dá)量變化趨勢也較相似，均在ZT8時(shí)（即下午16：00）達(dá)最高峰，呈現(xiàn)出24 h的晝夜節(jié)律，但在孕穗期和抽穗期的相對表達(dá)量明顯較高。在長日照和短日照基礎(chǔ)上施加不同光照處理下，F(xiàn)aFKF1基因均能通過自身調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境的變化，雖然表達(dá)峰出現(xiàn)時(shí)間不一致，但整體上能維持24 h的晝夜節(jié)律?！窘Y(jié)論】FaFKF1基因在細(xì)胞核發(fā)揮作用，且在不同光照下均呈現(xiàn)節(jié)律表達(dá)，受光周期的誘導(dǎo)調(diào)控。

關(guān)鍵詞： 高羊茅;FaFKF1基因;克隆;節(jié)律表達(dá);亞細(xì)胞定位

中圖分類號： S688.403.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2941-11

Cloning，subcellular location and rhythmic expression analysis of FaFKF1 gene in Festuca arundinacea

SHU Jian-hong，WANG Zi-yuan，LIU Xiao-xia，WANG Xiao-li*

（Institute of Prataculture，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang? 550006， China）

Abstract：【Objective】The blue light receptor family gene（FaFKF1） in Festuca arundinacea was cloned， its sequence characteristics and subcellular localization were analyzed， and its rhythmic expression characteristics under diffe-rent light treatments were detected， so as to provide a theoretical basis for exploring its regulatory mechanism in adult flowers and the adaptive breeding of F. arundinacea optoperiood. 【Method】The RACE technology was used to clone the full length cDNA of FaFKF1 gene. Its bioinformatics analysis was conducted. pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP fusion expression vector was constructed， infected tobacco epidermal cells by Agrobacterium mediated transfection to observe the fluorescent signal to determine protein subcellular localization.Meanwhile， the rhythmic expression characteristics of different light treatments and different growth stages of the FaFKF1 gene were detected using real-time? fluorescence quantitative PCR. 【Result】The sequence analysis results showed that the full-length cDNA（2266 bp） was obtained with a 1881 bp open reading frame（ORF），which encoded a small molecular protein containing 626 amino acids，the relative molecular weight of FaFKF1 protein was about 68.89 kD and its theoretical isoelectric point（pI） was 5.76，and the fat coefficient 80.99，instability index 39.81，which was a stable hydrophilic protein. Subcellular localization results showed that FaFKF1 was located in the nucleus. In the secondary structure of FaFKF1 protein， 24.92% of alpha helix，44.98% of random coil，23.61% of extended strand and 7.03% of beta turn were observed. FaFKF1 protein had the high amino acid sequence similarity with FKF1 of Glycine max（NP_001235886.2），Hordeum vulgare（KAE8795993.1）， and Brachypodium dilatatum （XP_003577479.1），reaching more than 85%. And the genetic distance with B. dilatatum was the shortest， followed by H. vulgare and wheat. Under long-day treatment， FaFKF1 gene was expressed in leaves during seedling， tillering， booting and heading stages， and the relative expression trend was similar， all peaked at ZT8 （16：00 PM）， showing a circadian rhythm of 24 h， but the relative expression was high in booting and heading stages. Under different light treatments based on long and short light exposure， the FaFKF1 gene could adapt to the environmental changes through autoregulation. Although the peak expression occurrence time was inconsistent， the overall circadian rhythm was maintained for 24 h. 【Conclusion】FaFKF1 gene may play an important role in the nucleus，and hasa rhythmic expression subcellular location under different lighting conditions，which is induced and regulated by the photoperiod.

Key words： Festuca arundinacea; FaFKF1 gene; cloning; rhythmic expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860674）; Special Fund Project of the Guizhou Science and Technology Platform and Talent Team（QKHPTRC〔2018〕5634）; Science and Technology Plan Project of Guizhou （QKHPTRC〔2020〕5005）

0 引言

【研究意義】植物不僅利用光作為光合作用的能源，還能感知環(huán)境的變化，并調(diào)整其發(fā)育進(jìn)程以提高其對當(dāng)?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)性（Zoltowski and Imaizumi et al.，2014）。開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的重要轉(zhuǎn)變過程，并受內(nèi)源節(jié)律基因和環(huán)境之間的相互作用調(diào)節(jié)。光周期是影響開花的重要環(huán)境因子，植物可通過感知光周期的變化啟動內(nèi)源相關(guān)開花因子來調(diào)節(jié)啟動開花（Han et al.，2015;王亞梁等，2020）。高羊茅（Festuca arundinacea）屬禾本科植物，需要長日照才能促進(jìn)開花，但貴州日照時(shí)間短、土壤貧瘠、氣候復(fù)雜，不能有效產(chǎn)生大量種子，目前高羊茅種子主要依靠進(jìn)口。FLAVIN-BINDING KELCHREPEAT F-BOX 1（FKF1）基因?qū)χ参镩_花具有重要調(diào)控作用。因此，對高羊茅FKF1基因克隆并進(jìn)行表達(dá)分析，探究FKF1基因在高羊茅光周期中的調(diào)控機(jī)制，對高羊茅的光周期育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物細(xì)胞含有多種不同類別的感光體，可吸收不同光譜的光，主要包括紅/遠(yuǎn)紅外光受體植物色素、藍(lán)光受體、隱色色素和光蛋白（Chen et al.，2004）。從模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)新的藍(lán)光受體家族蛋白，包含3個(gè)成員，即FKF1、LOV KELCH（LKP2）和ZEITLUPE（ZTL），這些蛋白均參與晝夜節(jié)律和開花時(shí)間的調(diào)節(jié)（David et al.，2000;Takase et al.，2011）。其中，F(xiàn)KF1蛋白不僅是藍(lán)光特異性受體，還是SKP-Cullin-Rbx-F-box（SCF） E3連接酶復(fù)合體的重要組成部分，首次發(fā)現(xiàn)于擬南芥晚花突變體中，其含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即LOV結(jié)構(gòu)域（吸收藍(lán)光）、F-box結(jié)構(gòu)域和Kelch-repeat（Song et al.，2014）。FKF1基因位于開花促進(jìn)基因（CONSTANS）CO和（Flowe-ring Locus T）FT基因的上游，可被藍(lán)光激活呈節(jié)律性表達(dá)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在黃昏時(shí)期 （Nelson et al.，2000;Imaizumiet al.，2003）。在光周期調(diào)控過程中，F(xiàn)KF1蛋白可誘導(dǎo)CO基因表達(dá)，且該過程具有光依賴性，從而說明FKF1基因的調(diào)控功能受光調(diào)節(jié)（Imaizumi et al.，2003）。在長日照條件下，fkf1突變體的開花明顯延遲。ZTL和LKP2基因的mRNA表達(dá)高峰在早上，而FKF1基因的mRNA表達(dá)高峰出現(xiàn)在下午，其蛋白表達(dá)水平在傍晚達(dá)最大值，且具有節(jié)律性（Song et al.，2013）。FKF1基因和節(jié)律調(diào)控基因GIGANTEA（GI）的表達(dá)受生物鐘控制，F(xiàn)KF1蛋白在調(diào)節(jié)CO轉(zhuǎn)錄時(shí)需要GI蛋白的參與（Fowler et al.，1999）。長日照下，F(xiàn)KF1蛋白與GI蛋白相互作用降解循環(huán)自由度因子CYCLING DOF FACTORS（CDF）并激活CO轉(zhuǎn)錄（Sawa et al.，2007）。FKF1蛋白還可調(diào)節(jié)CO基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的穩(wěn)定性（Song et al.，2012）。早上CDF轉(zhuǎn)錄因子抑制CO和FT基因表達(dá);下午FKF1蛋白的活性被激活，與GI蛋白形成復(fù)合物，從而降解CDF并誘導(dǎo)CO和FT基因轉(zhuǎn)錄致使擬南芥提早開花（Fornara et al.，2009）。但短日照下，光線不足會降低FKF1蛋白對GI蛋白的親和力，CDF升高，且無法誘導(dǎo)CO轉(zhuǎn)錄（霍軼瓊，2019）。另有研究表明，F(xiàn)KF1蛋白能通過多種反饋機(jī)制（包括CO的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后調(diào)控），誘導(dǎo)FT促進(jìn)開花（Fornara et al.，2009）。大豆GmFKF1基因過表達(dá)植株在長日照下表現(xiàn)為晚花，在短日照下有一半植株表現(xiàn)為極早花（李芳，2012），說明GmFKF1基因與擬南芥FKF1基因的作用相反。水稻OsFKF1基因在長日照下能促進(jìn)水稻開花，可互補(bǔ)擬南芥fkf1突變體的晚花表型（霍軼瓊，2019）。【本研究切入點(diǎn)】綜上所述，關(guān)于FKF1基因研究對象主要是大豆（李芳，2012）、擬南芥（Yuan et al.，2019）和水稻（霍軼瓊，2019）。FKF1基因在不同類型植物中的功能可能存在差異。高羊茅作為多功能草種，具有較大的應(yīng)用前景。但目前鮮見高羊茅FKF1基因（FaFKF1）的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以黔草1號高羊茅為試驗(yàn)材料，采用RACE和RT-PCR克隆FaFKF1基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同光照處理及不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，為進(jìn)一步探討FKF1的生物學(xué)功能提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的高羊茅品種為黔草1號，由貴州省草業(yè)研究所培育而成，2005年通過國家牧草新品種審定。TRIzolTM RNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶和SYBR Green I熒光定量染料均購自寶生物工程（大連）有限公司;瓊脂糖DNA回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司，RACE試劑盒購自TaKaRa公司;引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。主要儀器設(shè)備：RXZ型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Eppeddorf，德國）、DYY-6C型瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad GelDoc）。

1. 2 材料種植及光照處理

選取飽滿的高羊茅種子，流水清洗后用70%消毒酒精進(jìn)行表面消毒，離心后棄上清液，用ddH2O沖洗3次，再用0.7%次氯酸鈉溶液消毒15 min，離心棄上清液后用ddH2O沖洗。待種子干后均勻點(diǎn)播在MS培養(yǎng)基上，用封口膜封口后4 ℃進(jìn)行春化。將營養(yǎng)土與蛭石按1∶1比例混合裝盆，提前用水澆透。待培養(yǎng)基上的幼苗長出3～4片葉子時(shí)移栽至小花盆中，花盆中加入少許蛭石。將花盆置入光照培養(yǎng)箱中，其中長日照處理（LD，22 ℃，16 h/8 h）、短日照（SD，22 ℃，8 h/16 h），48 h后調(diào)節(jié)光照培養(yǎng)箱至連續(xù)光照（LL）和連續(xù)黑暗（DD）處理48 h，最后給于光照/黑暗（L/D，22 ℃，16 h/8 h）和黑暗/光照（D/L，22 ℃ 16 h/8 h）循環(huán)模式，定期澆營養(yǎng)液管理。待生長一個(gè)月后從早上8點(diǎn)（ZT0）開始取樣，每4 h取樣一次，分別表示為ZT4、ZT8、ZT12、ZT16和ZT20，連續(xù)取樣48 h。

1. 3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

于幼苗期取0.1 g新鮮高羊茅葉片加入液氮研磨，參照TRIzolTM RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ? μg總RNA，1.0 μL oligo（dT）引物，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 FaFKF1基因cDNA序列克隆

1. 4. 1 中間片段擴(kuò)增 采用ClustalX設(shè)計(jì)FaFKF1基因中間片段的2條簡并性引物FaFKF1-F1/FaFKF1-R1（表1）。以cDNA為模板進(jìn)行FaFKF1基因中間片段擴(kuò)增，反應(yīng)體系50.0 μL：2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶1.0 μL，cDNA模板5.0 μL，上、下游引物FaFKF1-F/FaFKF1-R（10μmol/L）各1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。?.8%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒回收純化后送至寶生物工程（大連）有限公司測序進(jìn)行測序。

1. 4. 2 5′RACE 根據(jù)中間片段序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3條特異性5′RACE引物。向反應(yīng)管中加入SuperScript II RT酶和引物GSP1合成cDNA第一鏈，隨后用RNase Mix去除RNA，對純化后cDNA進(jìn)行末端加上多聚C，從而獲得dC-tailed cDNA模板。將反應(yīng)管置于冰上進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：10×PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，10 μmol/L 引物GSP2和AAP各2.0 μL，dC-tailed cDNA模板5.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加無菌水補(bǔ)足至50.0 μL，擴(kuò)增程序同上。再用GSP3引物和通用擴(kuò)增引物AUAP（10 μmol/L）進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，然后切膠回收純化目的條帶，與pMD18-T連接后，挑選陽性克隆進(jìn)行測序。

1. 4. 3 3′RACE 使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTM Reverse Transcriptase對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用引物C413-0和UPM進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，cDNA模板2.5 μL，10 μmol/L C413-0 1.0 μL，10 μmol/L UPM 5.0 μL，PCR-Grade Water補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s 、72 ℃ 3 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行27個(gè)循環(huán)。將第一輪PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后稀釋50倍加入引物C413-1和UPM進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)體系和程序同第一輪。按照上述方法對PCR產(chǎn)物回收純化后測序。

利用DNAMAN 6.0將以上3個(gè)擴(kuò)增片段的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，從而得到目的基因的cDNA全長序列，將其提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析并預(yù)測其起始密碼子和終止密碼子。

1. 5 生物信息學(xué)分析

利用DNAStar 6.0將拼接獲得的cDNA全長序列翻譯成氨基酸序列，BLAST比對后并下載同源性較高的部分序列;利用ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protp-aram.html）預(yù)測分析蛋白的理化性;利用ProtScale（https：//web.expas-y.org/cgi-bin/pro-tscale/protscale.pl）進(jìn)行蛋白的親/疏水性預(yù)測分析;利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpredsopma.pl）分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成;利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 6 亞細(xì)胞定位

將FaFKF1基因連接至pCAMBIA1300-GFP載體上，以構(gòu)建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基過夜，隨機(jī)挑選1個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。加入的乙酰丁香酮（AS）和嗎啉乙磺酸（MES），28 ℃搖床培養(yǎng)OD值約1.0左右。常溫下4000 r/min離心10 min，15 min收集菌體，用含MgCl2重懸菌體至OD值為1.0，加入AS，靜置3 h以上，然后用注射器吸取侵染液注射到葉片內(nèi)作為處理組，以空載體pCAMBIA1300-GFP的煙草葉片為對照組，72 h后取樣通過激光共聚焦熒光顯微鏡檢測熒光信號。GFP激發(fā)光為488 nm，DAPI激發(fā)光為405 nm。

1. 7 基因表達(dá)分析

分別稱取長日照轉(zhuǎn)連續(xù)光照（LD-LL）和連續(xù)黑暗（LD-DD）、短日照轉(zhuǎn)連續(xù)光照（SD-LL）和連續(xù)黑暗（SD-DD）、光照和黑暗循環(huán)（L/D和D/L）處理下幼苗期的葉片及長日照處理下不同生長階段（苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期）的高羊茅葉片各0.1 g，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，具體方法與1.3相同。將合成的cDNA稀釋20倍作為模板，以FaFKF1-F2/FaFKF1-R2為引物，GAPDH（GA）為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同處理下高羊茅葉片F(xiàn)aFKF1基因的表達(dá)情況（羅維等，2020）。

1. 8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用2-△△Ct法計(jì)算FaFKF1基因的相對表達(dá)量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和圖表繪制采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2. 1 高羊茅FaFKF1基因擴(kuò)增

分別對FaFKF1基因的中間片段（673 bp）、5′端（406 bp）和3′端（1390 bp）序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。將三者進(jìn)行拼接得到FaFKF1基因的cDNA全長序列，大小為2266 bp，開放閱讀框（ORF）為1881 bp，編碼626個(gè)氨基酸殘基（圖2）。

2. 2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

將FaFKF1基因編碼的氨基酸序列與其他物種的FKF蛋白進(jìn)行BLAST對比，結(jié)果如圖3所示。該序列與大豆（Glycine max，NP_001235886.2）、大麥（Hordeum vulgare，KAE8795993.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003577479.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP_021317207.1）的FKF1蛋白氨基酸序列相似性較高，分別為79.5%、86.5%、87.68%和83.44%。

ProtParam分析結(jié)果顯示，F(xiàn)aFK1蛋白分子式為C3037H4740N864O905S33，相對分子量為68.89 kD，等電點(diǎn)（pI）5.76，不穩(wěn)定指數(shù)為39.81，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為76，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為61，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.247，脂肪系數(shù)為80.99，說明該蛋白為較穩(wěn)定的親水性蛋白。ProtScale預(yù)測蛋白親/疏水性結(jié)果顯示，蛋白親水性氨基酸均占70%，疏水性氨基酸均占30%，說明FaFKF1蛋白為親水性蛋白（圖4）。SOPMA二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲（占44.89%）、α-螺旋結(jié)構(gòu)（占24.92%）、延伸鏈（占23.16%）和β-轉(zhuǎn)角（占7.03%）（圖5）。

將FaFKF1蛋白的氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp比對分析，搜索下載不同物種的同源序列，采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖6所示。FaFKF1蛋白與二穗短柄草、大麥和小麥的FKF1蛋白處于同一小分支，說明三者的親緣關(guān)系較近，其中，與二穗短柄草FKF1的親緣關(guān)系最近，與大豆、舞草和高粱FKF1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2. 3 亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞，然后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)可見明顯的綠色熒光，處理組僅在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核檢測到綠色熒光信號，即FaFKF1蛋白定位于細(xì)胞核中（圖7）。

2. 4 FaFKF1基因的表達(dá)分析結(jié)果

2. 4. 1 長日照處理下FaFKF1基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)情況 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測長日照處理下FaFKF1基因在高羊茅苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖8所示。FaFKF1基因在不同生長階段的葉片均有表達(dá)，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且4個(gè)時(shí)期的相對表達(dá)量變化趨勢也較相似，均在ZT8時(shí)（即下午16：00）達(dá)最高峰，呈現(xiàn)出24 h的晝夜節(jié)律。不同的是，F(xiàn)aFKF1基因在孕穗期和抽穗期的相對表達(dá)量明顯增加。表明FaFKF1基因主要在抽穗前發(fā)揮調(diào)控作用。

2. 4. 2 FaFKF1基因在長日照和短日照分別轉(zhuǎn)入連續(xù)光照和連續(xù)黑暗下的表達(dá)情況 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測在長日照和短日照分別轉(zhuǎn)入連續(xù)光照和連續(xù)黑暗處理下高羊茅葉片中FaFKF1基因表達(dá)情況，如圖9所示。LD-LL處理下，F(xiàn)aFKF1基因在第1個(gè)光周期內(nèi)ZT0時(shí)相對表達(dá)量最大，隨著光照時(shí)間增加其相對表達(dá)量逐漸降低;在第2個(gè)光周期也是ZT0處出現(xiàn)一個(gè)小的表達(dá)峰，在ZT8時(shí)相對表達(dá)量最大。LD-DD處理下，F(xiàn)aFKF1基因在2個(gè)光周期的表達(dá)規(guī)律基本一致，且表達(dá)峰均出現(xiàn)在ZT0。SD-LL處理下，F(xiàn)aFKF1基因的相對表達(dá)量比LD-LL處理下的相對表達(dá)量高，在第1個(gè)光周期內(nèi)ZT12處有1個(gè)小的表達(dá)峰，隨后ZT20時(shí)相對表達(dá)量達(dá)最大值;在第2個(gè)光周期的表達(dá)峰提前，在ZT4時(shí)相對表達(dá)量達(dá)最大。SD-DD處理下，F(xiàn)aFKF1基因在第1個(gè)光周期的相對表達(dá)量高于第2個(gè)光周期，兩個(gè)光周期的表達(dá)峰分別出現(xiàn)在ZT4和ZT8。綜上所述，連續(xù)光周期處理后，F(xiàn)aFKF1的表達(dá)高峰出現(xiàn)的時(shí)間有所改變 ，說明FaFKF1基因能自我調(diào)節(jié)從而最大程度適應(yīng)光照的改變。

2. 4. 3 FaFKF1基因在光照和黑暗循環(huán)處理下的表達(dá)情況 FaFKF1基因在L/D處理下的相對表達(dá)量最大，在光照ZT8時(shí)出現(xiàn)表達(dá)峰，第2個(gè)光周期ZT20即凌晨相對表達(dá)量最大（圖10-A）。L/D-D/L處理下，F(xiàn)aFKF1基因的表達(dá)量較L/D處理急劇下降，表達(dá)峰都出現(xiàn)在ZT20（圖10-B）。在D/L處理下，F(xiàn)aFKF1基因在第1個(gè)光周期開始相對表達(dá)量基本無變化，直到ZT16時(shí)開始增加，ZT20時(shí)達(dá)最大，并在第2個(gè)光周期內(nèi)ZT4和ZT12有2個(gè)次級表達(dá)峰，最高峰仍出現(xiàn)在ZT20（圖10-C）。L/D-L/D處理下，第1個(gè)光周期內(nèi)相對表達(dá)量高于第2個(gè)光周期，且表達(dá)峰均出現(xiàn)在ZT12（圖10-D）。綜上所述，F(xiàn)aFKF1基因在光照時(shí)的表達(dá)水平高于黑暗時(shí)的表達(dá)水平。

3 討論

自2000年FKF1基因被克隆以來，其功能不斷被發(fā)掘（Nelson et al.，2000）。FKF1、ZTL和LKP2蛋白的結(jié)構(gòu)相似，同屬于ZTL家族，但三者在光周期調(diào)控植物開花途徑中有所不同，其中，ZTL基因在短日照下對開花作用不明顯，而LKP2基因無論長日照還是短日照均能增強(qiáng)擬南芥ztl突變體表型（Somers et al.，2004）。Takase等（2011）通過二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和三級結(jié)構(gòu)建模確定FKF1蛋白含有LOV結(jié)構(gòu)域，可形成穩(wěn)定的二聚體，表明FKF1蛋白較穩(wěn)定。本研究利用ProtParam預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aFKF1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為39.84（<40.00），推測其為穩(wěn)定蛋白，與Takase等（2011）的研究結(jié)果一致。利用NCBI數(shù)據(jù)庫將FaFKF1蛋白與其他物種同源蛋白進(jìn)行BLAST對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與禾本科植物FKF1蛋白的氨基酸序列相似性較高，且系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示FaFKF1蛋白與禾本科植物二穗短柄草、大麥和小麥的FKF1蛋白親緣關(guān)系較近，進(jìn)一步說明FaFKF1蛋白的進(jìn)化關(guān)系穩(wěn)定，具有一定的保守性。本研究將構(gòu)建的融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細(xì)胞，然后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，結(jié)果顯示，F(xiàn)aFKF1蛋白定位于細(xì)胞核，與擬南芥（Tomoyuki et al.，2011）、大豆（李芳，2012）和玉米（劉玲，2014）的FKF1蛋白定位一致。

擬南芥AtFKF1基因在長日照處理下可促進(jìn)開花，且表達(dá)峰出現(xiàn)在早上10點(diǎn)左右，在短日照下促進(jìn)作用不明顯（Imaizumi et al.，2003），其表達(dá)峰較長日照提前3 h。大豆GmFKF1轉(zhuǎn)基因植株在長日照處理下表現(xiàn)大部分晚花，短日照處理下有一半表現(xiàn)為極早花。大豆GmFKF1基因在長日照下中午12點(diǎn)達(dá)表達(dá)峰，短日照下早上10點(diǎn)達(dá)最大（Li et al.，2013）。水稻OsFKF1基因在長日照下的表達(dá)峰時(shí)間與野生型（WT）相似，但比fkf1-2突變體要早。洋蔥AcFKF1無論長日照還是短日照表達(dá)峰都出現(xiàn)在早上7～8點(diǎn)左右（Taylor et al.，2010）。關(guān)于FKF1基因表達(dá)的調(diào)控研究對象以大豆、水稻等植物居多，鮮見以高羊茅為材料的相關(guān)研究報(bào)道，其原因可能是高羊茅為六倍體，基因組信息了解較少，大多研究只停留在長日照和短日照光照處理方面。本研究在長日照和短日照基礎(chǔ)上施加不同光照處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論給予何種光照處理，F(xiàn)aFKF1基因均能通過自身調(diào)節(jié)來適應(yīng)環(huán)境的變化，雖然表達(dá)峰出現(xiàn)時(shí)間不一致，但整體上能維持24 h的晝夜節(jié)律。目前，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥（Yuan et al.，2019）、水稻（霍軼瓊，2019）等FKF1基因在不同組織中均有表達(dá)，且均在葉片中的表達(dá)水平最高。霍軼瓊（2019）研究證實(shí)了FaFKF1基因在水稻中的表達(dá)量隨著發(fā)育時(shí)期總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。本研究對長日照處理下FaFKF1基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FaFKF1基因從早上8：00開始總體呈先升后降的趨勢，該結(jié)果與水稻不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)相似（霍軼瓊，2019）。在苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期其表達(dá)峰均出現(xiàn)在ZT8時(shí)，即下午16：00，后續(xù)可通過構(gòu)建超表達(dá)載體和基因敲除等方法來進(jìn)一步驗(yàn)證高羊茅FaFKF1基因的調(diào)控功能。

4 結(jié)論

FaFKF1基因在細(xì)胞核發(fā)揮作用，且在不同光照下均呈現(xiàn)節(jié)律表達(dá)，受光周期的誘導(dǎo)調(diào)控。

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收稿日期：2020-10-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860674）;貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目（黔科合平臺人才〔2018〕5634）;貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合平臺人才〔2020〕5005）

通訊作者：王小利（1977-），https：//orcid.org/0000-0002-2868-9386，研究員，主要從事牧草分子生物學(xué)研究工作，E-mail：wangxiao-lizhenyuan@126.com

第一作者：舒健虹，（1972-），https：//orcid.org/0000-0002-7899-3167，高級農(nóng)藝師，主要從事牧草育種與生物技術(shù)研究工作，E-mail： gzsjhong@126.com