錢瑭毅 王偉繼 李 苗 單秀娟 金顯仕

黃海中國(guó)對(duì)蝦環(huán)境DNA (eDNA)的垂直分布規(guī)律及其影響因素初探*

錢瑭毅1,2王偉繼2,3李 苗2單秀娟2,3①金顯仕2,3

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 大連 116036；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

準(zhǔn)確掌握物種分布和種群動(dòng)態(tài)是漁業(yè)資源評(píng)估的基礎(chǔ)。然而，對(duì)某些種群規(guī)模小或生活史復(fù)雜的物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)的難度很大。近年來(lái)，環(huán)境DNA技術(shù)快速興起，已被廣泛應(yīng)用于各類物種監(jiān)測(cè)、生物多樣性評(píng)估和生物量評(píng)價(jià)等領(lǐng)域。為了解冬季中國(guó)對(duì)蝦()越冬洄游過(guò)程中的分布情況，2019年12月在黃海中南部采集表、中、底3個(gè)水層水樣，檢測(cè)其中中國(guó)對(duì)蝦的eDNA，并對(duì)表層沉積物進(jìn)行室內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，中國(guó)對(duì)蝦eDNA在自然水體中呈現(xiàn)特殊的垂直分布規(guī)律：底層濃度高，表層濃度低，這一規(guī)律與中國(guó)對(duì)蝦生活習(xí)性相關(guān)；表層沉積物會(huì)在外力作用下再懸浮，并向周圍釋放eDNA，對(duì)水體造成較大程度影響，本研究將采集到的表層沉積物分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組最大釋放量分別為1624.06、3453.34和1143.24 copies/L，沉積物對(duì)水體的影響持續(xù)1周左右。

環(huán)境DNA；中國(guó)對(duì)蝦；分布規(guī)律；表層沉積物；生物量評(píng)估

準(zhǔn)確地掌握目標(biāo)物種的分布信息是生物多樣性研究的必要前提之一，且對(duì)生物地理學(xué)、保護(hù)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研究也具有重要意義(Lodge, 2012, Ficetola, 2008)。與陸地環(huán)境不同，受到水深、溫度、光照、壓力等諸多因素限制，對(duì)水生生物進(jìn)行直接觀察和識(shí)別難度很大(Bogich, 2008)，特別是某些低密度或具有獨(dú)特生活史的種群(Dejean, 2011)。目前，傳統(tǒng)調(diào)查方法，例如拖網(wǎng)、影像和聲學(xué)調(diào)查等，通常成本高昂且會(huì)對(duì)珍稀物種造成巨大威脅(Murphy, 2010)。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，環(huán)境DNA (environmental DNA, eDNA)技術(shù)的出現(xiàn)使得“非侵入”式資源調(diào)查和物種跟蹤成為可能(Taberlet, 2012)。該技術(shù)是通過(guò)采集并檢測(cè)生物體向水環(huán)境中釋放的DNA片段來(lái)判斷生物是否存在于該水域，并進(jìn)行生物量評(píng)估的一種新興技術(shù)(Ficetola, 2008; Takahara, 2012)。eDNA的來(lái)源廣泛，可以是生物的表皮、黏液、糞便、尿液和生殖細(xì)胞等(Turner, 2015; Klymus, 2015; Wilcox, 2015)，并且只需通過(guò)少量水樣的采集分析即可滿足調(diào)查目的(Thomsen, 2012a、b)，從而降低采樣成本，減少采樣工作對(duì)環(huán)境和生物體的干擾和破壞。eDNA技術(shù)很大程度地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)調(diào)查方法的不足，在物種保護(hù)和生物量評(píng)估等方面發(fā)揮重要作用。

已有學(xué)者對(duì)eDNA在河流中的擴(kuò)散或降解進(jìn)行研究(Deiner, 2014; Jane, 2015; Sansom, 2017)，發(fā)現(xiàn)水體中的eDNA在自然條件下易降解，且會(huì)在環(huán)境中擴(kuò)散，以短片段的形式移動(dòng)到遠(yuǎn)離釋放源的位置。此外，僅依靠分析eDNA本身無(wú)法就其源頭及釋放時(shí)間進(jìn)一步溯源。然而，對(duì)于在面積、水流及深度相比河流都更為復(fù)雜的海洋環(huán)境中，eDNA的分布規(guī)律及變化研究仍舊十分有限(Yamamoto, 2016; O’Donnell, 2017)。了解eDNA在水體中擴(kuò)散和滯留的規(guī)律對(duì)于采樣設(shè)計(jì)和空間推斷(即樣本所代表的可能出現(xiàn)的目標(biāo)生物的位置)具有重要意義(Shogren, 2017)。對(duì)水體中eDNA變化規(guī)律的闡釋是利用其進(jìn)行目標(biāo)物種追蹤及生物量評(píng)估的前提。一般而言，利用eDNA技術(shù)對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行追蹤是為獲取其準(zhǔn)確的分布位置和種群信息。而eDNA在水體中的分布受多種因素影響，包括物種分布、水流、沉降和沉積物再懸浮等(Deiner, 2014; Robison, 1981; Saba, 2012; Wotton, 2001; Maggi, 2013)。這些除物種分布以外的其他因素的影響所導(dǎo)致eDNA的雜亂分布是研究者不想看到的。如何避免這些因素影響，從而通過(guò)eDNA獲取有效的目標(biāo)物種信息是研究者一直以來(lái)想要解決的問(wèn)題。而目前已有研究對(duì)eDNA的水平分布討論較多(Thalinger, 2019)，很少涉及垂直分布的特點(diǎn)，或只涉及了單一介質(zhì)(Turner, 2015)。本研究選用中國(guó)對(duì)蝦()作為目標(biāo)物種，選擇平均水深較大的黃海作為研究水域，以eDNA垂直分布作為主要考察要素。鑒于沉積物也會(huì)對(duì)水體中eDNA濃度造成一定程度的影響(Turner, 2015; 魏楠等, 2020)。將水體與沉積物的相互效應(yīng)也考慮在內(nèi)，希望能更加科學(xué)合理地解釋eDNA的分布特點(diǎn)。本研究分為兩部分內(nèi)容：(1) 在黃海中南部海域8個(gè)站位的不同水深(表、中、底)采水，研究水體中中國(guó)對(duì)蝦eDNA的分布規(guī)律；(2) 采集表層沉積物并進(jìn)行室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分析沉積物對(duì)水體的影響方式。通過(guò)本研究希望能夠了解中國(guó)對(duì)蝦eDNA在水中的分布規(guī)律和影響因素，更合理地設(shè)計(jì)采樣工作以及更有效地將eDNA技術(shù)推廣到其他物種的研究中。

1 材料與方法

1.1 采樣站位

樣品來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所藍(lán)海101號(hào)科研調(diào)查船于2019年12月21日在黃海的調(diào)查。根據(jù)鄧景耀等(1990)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦的研究方法，在中國(guó)對(duì)蝦越冬洄游路線上，選取8個(gè)站位，利用分層采水方法在各站位分別采集表、中、底3個(gè)水層水樣。其中，表層水在距海面3 m深的位置取水，中層水在20 m左右水深采水，底層水在該站位水深于海底以上5 m左右位置取水(具體采樣深度根據(jù)海況及作業(yè)難度有所變動(dòng))，具體采樣位置見(jiàn)圖1，采樣水深信息見(jiàn)表1。

圖1 2019年12月黃海采樣站位

1.2 目的基因及特異性引物

選擇中國(guó)對(duì)蝦的線粒體細(xì)胞色素C氧化亞基Ⅰ基因(mtDNA COⅠ)進(jìn)行研究。引物參照李苗等(2019)，其中，COI PF與COI PR作為普通PCR引物用來(lái)制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA。COI DF與COI DR作為定量PCR引物，擴(kuò)增的目的片段為普通PCR引物所擴(kuò)增片段的一部分。引物與探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 各站位采樣水深

Tab.1 Station location and sampling depth

1.3 中國(guó)對(duì)蝦eDNA富集

使用濾膜法對(duì)海水中eDNA進(jìn)行富集。選取直徑為47 mm、孔徑為0.45 μm的玻璃纖維濾膜對(duì)1 L所采水樣過(guò)濾(李苗等, 2019)，每個(gè)水樣取3個(gè)平行樣本及3個(gè)陰性對(duì)照，共計(jì)75個(gè)樣本。為避免樣品相互污染，過(guò)濾完后每張濾膜用錫紙單獨(dú)包裹再放入封口袋中并做好標(biāo)記，–20℃保存直到進(jìn)行DNA提取。

1.4 eDNA提取

使用試劑盒進(jìn)行eDNA提取，具體提取方法參照Renshaw等(2015)并加以改進(jìn)，其具體提取步驟為：

(1)將濾膜從冰箱取出后，用剪刀去除濾膜邊緣多余部分，再剪成條狀，置于2 ml無(wú)菌離心管中；向離心管內(nèi)加入570 μl的Buffer ATL和60 μl的蛋白酶K溶液(20 mg/ml)，渦旋震蕩，將混合液混合均勻，在恒溫水浴鍋內(nèi)65℃水浴3 h，水浴期間，每隔15 min輕輕顛倒混勻離心管，使其充分裂解，裂解完成后取出并擠干剩余濾膜；

(2)向離心管內(nèi)加入630 μl的Buffer AL和630 μl的無(wú)水乙醇，渦旋震蕩15 s，使其混合均勻；將2 ml 離心管中的混合液轉(zhuǎn)移到DNeasy離心柱中，25℃ 8000離心1 min；

表2 本研究用到的引物與探針

Tab.2 Primers and probes used in this study

(3)向離心柱內(nèi)加入500 μl Buffer AW1，25℃ 8000離心1 min，再向離心柱內(nèi)加入500 μl Buffer AW2，25℃ 8000離心3 min；

(4)將離心柱放入1.5 ml的無(wú)菌離心管中，在離心柱中央加入100 μl Buffer TE，25℃孵育1 min。25℃ 8000離心1 min；

eDNA提取完成后，立即使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及質(zhì)量，若eDNA樣品的濃度高于250 ng/μl (實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒要求待測(cè)樣品的DNA濃度低于250 ng/μl)，則將其進(jìn)行稀釋。在每個(gè)eDNA樣品內(nèi)吸取10 μl DNA溶液，用作瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及PCR定量分析，其余90 μl eDNA溶液–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 中國(guó)對(duì)蝦eDNA定量分析

所有提取的eDNA樣品采用BBI生命科學(xué)有限公司的2×Man Fast qPCR Master Mix (Low Rox)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行定量分析。定量PCR (Quantitative PCR, qPCR)擴(kuò)增的反應(yīng)體系按照試劑盒說(shuō)明書要求采用20 μl體系(表3)。qPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 5 s，60℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。qPCR擴(kuò)增儀器為ABI 7500型定量PCR儀，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA與未知濃度eDNA樣品在每個(gè)96孔板均設(shè)計(jì)3個(gè)qPCR重復(fù)，每個(gè)96孔板設(shè)置3個(gè)陰性對(duì)照(無(wú)模板)與3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(中國(guó)對(duì)蝦基因組DNA)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA依次從107copies/μl以10倍的濃度梯度稀釋到10 copies/μl。實(shí)驗(yàn)獲得的所有數(shù)據(jù)采用絕對(duì)定量法分析，每個(gè)eDNA樣品最終的拷貝數(shù)以陽(yáng)性擴(kuò)增樣品的平均值為準(zhǔn)，應(yīng)用系統(tǒng)軟件SDS 1.4.0.25自動(dòng)計(jì)算值，并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線與擴(kuò)增曲線。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及用量

Tab.3 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system and dosage

1.6 表層沉積物釋放實(shí)驗(yàn)設(shè)置

選擇黃海中南部的3個(gè)站位(8694、10594和13994)采集表層沉積物(采樣站位根據(jù)該海域底質(zhì)類型進(jìn)行選擇)。表層沉積物的采集工作在同一航次中完成，采樣時(shí)，將采泥器垂直下放至海底抓取沉積物，待采泥器閉合后提出海面移至夾板，排出采泥器中殘留海水以避免沉積物懸浮進(jìn)入水體。采樣前后，采泥設(shè)備用雙蒸水沖洗2遍以避免樣品交叉污染。樣品放入無(wú)菌封口袋，于–20℃冷庫(kù)中保存，運(yùn)輸過(guò)程用冰塊保持溫度在–10℃左右，避免樣品反復(fù)凍融。2020年1月3日樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3個(gè)站位的表層沉積物分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為1個(gè)15 L的塑料整理箱(長(zhǎng)×寬×高：35 cm × 24 cm × 20 cm)，內(nèi)裝1000 g沉積物樣品和10 L人工海水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所用人工海水經(jīng)實(shí)驗(yàn)室qPCR檢測(cè)，無(wú)中國(guó)對(duì)蝦eDNA存在。實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)時(shí)，分別混勻3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，待沉積物重新沉淀后，采集1 L上層水樣(3個(gè)平行樣品)進(jìn)行中國(guó)對(duì)蝦eDNA富集，濾膜用錫紙單獨(dú)包裝，–20℃保存待用。取樣后向整理箱中重新加入3 L人工海水以保證下次取樣濃度一致。每日15:00取樣，連續(xù)進(jìn)行1周。所有實(shí)驗(yàn)組均在室內(nèi)進(jìn)行，室溫保持在10℃，水溫保持在6℃并通過(guò)空氣泵持續(xù)曝氣。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)備均在實(shí)驗(yàn)前用高錳酸鉀消毒，并用雙蒸水沖洗。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有樣品統(tǒng)一進(jìn)行eDNA的提取和qPCR檢測(cè)。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中國(guó)對(duì)蝦eDNA的富集、提取及qPCR分析方法同上(1.3、1.4和1.5)。

表4 實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置

Tab.4 Setting of experimental condition

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后使用Excel 2016、R 3.6.3及其集成開發(fā)環(huán)境R Studio軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗(yàn)證

2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，引物COI DF/ DR成功擴(kuò)增了中國(guó)對(duì)蝦mtDNA COⅠ長(zhǎng)度為106 bp的目的片段，電泳條帶單一明亮、無(wú)雜帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明所選引物特異性良好。

2.2 中國(guó)對(duì)蝦COⅠ基因qPCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖3可以看出，本實(shí)驗(yàn)稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度在10~107copies/μl范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，說(shuō)明本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)中國(guó)對(duì)蝦mtDNA COⅠ基因的擴(kuò)增。

2.3 中國(guó)對(duì)蝦eDNA分布規(guī)律

檢測(cè)結(jié)果顯示，在黃海8個(gè)站位的表、中、底水樣中，底層eDNA拷貝數(shù)與表層和中層具有顯著差異(=0.003,=0.0009)。除個(gè)別站位外，底層水體eDNA拷貝數(shù)均大于表、中層水體(表5)。8894、12394和14194站位表層eDNA濃度大于中層，其中，14194站位表層eDNA濃度最高，呈現(xiàn)了中國(guó)對(duì)蝦eDNA分布規(guī)律為表層少、底層多(圖4)。

2.4 表層沉積物釋放實(shí)驗(yàn)

室內(nèi)沉積物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表層沉積物在外力作用下會(huì)向水體中釋放大量中國(guó)對(duì)蝦eDNA，其中，8694與10594站位在實(shí)驗(yàn)第1天釋放量最高，分別為1624.06和3453.34 copies/L，而13994站位在第2天釋放量達(dá)到最高，為1143.24 copies/L。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組沉積物釋放的eDNA拷貝數(shù)與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。均在第7天(2020年1月9日)趨于穩(wěn)定且保持在較低水平(表6和圖5)。

圖2 qPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

M: DNA Marker DL 2000；–：負(fù)極；+：正極；連續(xù)3列泳道為同一采樣站位

M: DNA Marker DL 2000; –: Negative electrode; +: Positive electrode; Three rows of lanes are for the same sampling station

圖3 中國(guó)對(duì)蝦mtDNA COⅠ基因qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

3.1 生物習(xí)性對(duì)其eDNA分布的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)對(duì)蝦在垂直方向上具有顯著的分布規(guī)律。結(jié)合目標(biāo)物種在不同發(fā)育階段的生活習(xí)性和實(shí)際環(huán)境條件，對(duì)eDNA濃度進(jìn)行分析推測(cè)，能夠分析得到更為準(zhǔn)確的物種分布位置和生物量情況。以往研究表明，中國(guó)對(duì)蝦在越冬場(chǎng)主要以底棲的甲殼類、瓣鰓類、多毛類、蛇尾類()及小型魚類為食，還會(huì)攝食寄居蟹皮海綿()(鄧景耀等, 1990)。根據(jù)中國(guó)對(duì)蝦這一攝食習(xí)性，可以推測(cè)中國(guó)對(duì)蝦在黃海越冬洄游過(guò)程中應(yīng)該集中分布于底層水體。而檢測(cè)結(jié)果與這一推測(cè)相符：越冬期中國(guó)對(duì)蝦eDNA底層濃度相對(duì)較大。同時(shí)，糞便和外殼作為越冬期中國(guó)對(duì)蝦的主要eDNA來(lái)源，由于涌浪和沉降作用，這些物質(zhì)會(huì)變成細(xì)小碎屑沉至底層水體(Turner, 2015)，也會(huì)導(dǎo)致底層水體中國(guó)對(duì)蝦eDNA濃度升高。此外，不同物種或同一物種在不同發(fā)育階段，其eDNA的釋放速率也存在一定差異 (Minamoto, 2017; Maruyama, 2014)。將種群構(gòu)成因素納入到考量范圍，也是提高eDNA技術(shù)準(zhǔn)確性的有效途徑。

表5 黃海8個(gè)站位不同水深中國(guó)對(duì)蝦eDNA濃度

Tab.5 Concentrations of F. chinensis eDNA in different water depths at eight stations in Yellow Sea (copies/L)

圖4 黃海8個(gè)站位不同水深中國(guó)對(duì)蝦eDNA濃度

表6 表層沉積物釋放中國(guó)對(duì)蝦eDNA濃度

Tab.6 Variations of environmental DNA concentration of F. chinensis released from the surface substrate (copies/L)

圖5 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中國(guó)對(duì)蝦eDNA的濃度變化

3.2 水體渾濁度對(duì)eDNA分布的影響

結(jié)果顯示，中國(guó)對(duì)蝦的eDNA在自然水體中總體呈現(xiàn)底層濃度高、表層濃度低的特點(diǎn)，但8894、12394和14194的檢測(cè)結(jié)果與其他站位存在差異。在采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，這3站的水體較為渾濁，泥沙量大，可能是導(dǎo)致eDNA濃度反常變化的原因之一，懷疑該海域存在垂直流，導(dǎo)致底部泥沙懸浮，從而對(duì)eDNA濃度存在一定程度影響。具體影響方式需要開展更多實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

3.3 沉積物對(duì)eDNA分布的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，eDNA會(huì)在水體與沉積物之間雙向移動(dòng)，糞便和外殼作為中國(guó)對(duì)蝦越冬期的主要eDNA來(lái)源，不僅會(huì)在沉降作用下進(jìn)入沉積物，并且沉積物會(huì)在外力(如垂直流、底棲生物擾動(dòng)和人為干擾等)作用下，導(dǎo)致沉積物再懸浮(Turner, 2015)，向周圍釋放eDNA，使得底層水體eDNA濃度升高，從而使測(cè)量值高于真實(shí)值。研究表明，eDNA會(huì)在水體與沉積物之間轉(zhuǎn)移，因此，將沉積物與水體結(jié)合進(jìn)行分析更有意義(Leff, 1992)。相比水體，沉積物中含有更多的eDNA(Corinaldesi, 2005; Dell’Anno, 2004)。其原因是：(1) 生物的糞便、外殼和脫落的組織會(huì)在沉降作用下進(jìn)入沉積物中，使沉積物中eDNA濃度升高(Turner, 2015)；(2) eDNA可被沉積物中的表面活性顆粒吸附，受保護(hù)而不被降解，并且這些顆粒還會(huì)吸附核酸酶，導(dǎo)致酶活性降低，從而延長(zhǎng)eDNA降解時(shí)間(Pietramellara, 2009)，使沉積物中eDNA不斷積累，濃度上升。以上兩點(diǎn)說(shuō)明了沉積物在eDNA研究中的重要性。但大多數(shù)研究只是單獨(dú)對(duì)沉積物中的eDNA進(jìn)行研究，鮮有研究者將沉積物與周圍環(huán)境結(jié)合看待(魏楠等, 2020)，因而沉積物對(duì)周圍環(huán)境的影響極易被忽視。本研究揭示了沉積物通過(guò)再懸浮釋放eDNA的方式對(duì)周圍水體造成巨大影響，如何屏蔽這一影響，減少測(cè)量誤差，是接下來(lái)研究的重點(diǎn)。

3.4 再懸浮eDNA殘留時(shí)間的區(qū)別

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表層沉積物中的中國(guó)對(duì)蝦eDNA溶解進(jìn)入水體7 d后近乎完全降解。而這與李苗等(2018)對(duì)中國(guó)對(duì)蝦eDNA水中殘留時(shí)間的研究結(jié)果存在差異，其研究發(fā)現(xiàn)，新鮮的eDNA可以在水體中殘留27 d。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，eDNA降解時(shí)間受eDNA濃度影響。eDNA濃度較高，其降解時(shí)間較長(zhǎng)(李苗等, 2020)?？紤]到本研究的樣本是在野外采集到的，其濃度遠(yuǎn)比養(yǎng)殖場(chǎng)中的樣品濃度小。因此，本研究中沉積物釋放的eDNA殘留時(shí)間相對(duì)較短。另外，新鮮的eDNA被生物體釋放進(jìn)入水體時(shí)發(fā)生降解，致使片段長(zhǎng)度縮短，并在沉降作用下保留在沉積物中，沉積物又在外力作用下再懸浮，導(dǎo)致所釋放短片段eDNA環(huán)境改變，加速了降解過(guò)程，因此，沉積物釋放的eDNA僅能殘留較短時(shí)間。已有研究表明，不同片段長(zhǎng)度的eDNA在殘留時(shí)間上具有顯著差異(Dejean, 2011)。在以后的研究中，可以根據(jù)eDNA片段長(zhǎng)度的不同，對(duì)eDNA進(jìn)行區(qū)分，選擇合適的引物長(zhǎng)度進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以此降低沉積物釋放的干擾。

在了解目標(biāo)生物的生活習(xí)性的前提下，研究人員進(jìn)行有針對(duì)性的采樣設(shè)計(jì)，可以使檢測(cè)結(jié)果更加可信。但需要對(duì)再懸浮的eDNA進(jìn)行有效區(qū)分，以避免測(cè)量結(jié)果的誤差，從而將eDNA技術(shù)更好地推廣到其他水生物種的生態(tài)系統(tǒng)研究中。

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A Preliminary Study on the Vertical Distribution ofEnvironmental DNA in the Yellow Sea and Its Influencing Factors

QIAN Tangyi1,2, WANG Weiji2,3, LI Miao2, SHAN Xiujuan2,3①, JIN Xianshi2,3

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116036; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shandong Provincial Key Laboratory of Fishery Resources and Eco-Environment, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Accurate knowledge of species distributions and population dynamics is the basis for fishery resource assessments. However, it is difficult to monitor certain species with small populations or complex life histories. Recently, as a new monitoring technology, environmental DNA (eDNA) has been widely used in species monitoring, biodiversity assessments, and biomass assessments. In this study, eDNA technology was employed to understand the distribution of Chinese shrimp during its winter migration. In December 2019, we collected water samples from three water layers in the south-central Yellow Sea to test the eDNA of Chinese shrimp. In addition, laboratory experiments were carried out on the surficial sediments of the seabed. First, it was found that the eDNA of Chinese shrimp exhibited a specific vertical distribution in the natural water, which was characterized by a high concentration in the bottom layer and low concentration in the surface layer. This distribution is related to the life habits of Chinese shrimp. Second, the surficial sediments would re-suspend and release eDNA to the surrounding areas under the action of external forces, causing a large impact on the water. In this study, the surficial sediments were divided into three experimental groups. The maximum amounts of eDNA released by the three experimental groups were 1624.06, 3453.34, and 1143.24 copies/L, the effects of which lasted for approximately a week. It is hoped that this study will assist with the eDNA sampling design in the future.

Environmental DNA;Chinese shrimp; Distribution; Surficial sediment; Biomass assessment

SHAN Xiujuan, E-mail: shanxj@ysfri.ac.cn

S932.5+1

A

2095-9869(2021)02-0001-09

10.19663/j.issn2095-9869.20200525002

http://www.yykxjz.cn/

錢瑭毅, 王偉繼, 李苗, 單秀娟, 金顯仕. 黃海中國(guó)對(duì)蝦環(huán)境DNA(eDNA)的垂直分布規(guī)律及其影響因素初探. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(2): 01–09

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* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31872692)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFE0104400)、山東省支持青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室重大科技專項(xiàng)(2018SDKJ0501-1)、山東省泰山學(xué)者專項(xiàng)基金項(xiàng)目和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2019GH16)共同資助[This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31872692), National Key Research and Development Program (2017YFE0104400), Pilot National Laboratory of Marine Science and Technology (Qingdao), Shandong Province (2018SDKJ0501-1), Taishan Scholars Project of Shandong Province, and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2019GH16)]. 錢瑭毅，E-mail: 389168510@qq.com

單秀娟，研究員，E-mail: shanxj@ysfri.ac.cn

2020-05-25,

2020-06-09

(編輯 馮小花)