覃發(fā)興，孟婷婷，馬樂凡*，張旭桃，李洪兵

(1.長沙理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2.國家生活用紙產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，湖南 常德 415001；3.湖南鴻鷹生物科技有限公司，湖南 常德 415400 )

樹脂是植物纖維原料中存在的一類親脂性化合物，約占原料總量的2%～8%，其化學(xué)組成比較復(fù)雜，主要包括甘油三酯、脂肪酸、樹脂酸、甾醇、萜烯和烷烴等。在造紙生產(chǎn)的制漿和打漿過程中，殘留于木材薄壁細胞和樹脂道中的樹脂會進入漿水體系，形成膠體狀樹脂[1-3]；這些膠狀物能絮聚形成大顆粒，沉積在設(shè)備和產(chǎn)品上，影響制漿造紙設(shè)備的正常運行和使用壽命，增加停機清洗的次數(shù)，影響生產(chǎn)操作的正常進行，并降低產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量[4-5]。目前，控制紙漿樹脂障礙的措施主要包括：增加原料貯存過程中樹脂類物質(zhì)自然風化和生物降解，以及對制漿造紙生產(chǎn)過程中的樹脂采用物理控制法、化學(xué)控制法和生物控制法來分解并脫除。生物控制法中的生物酶處理與制漿造紙生產(chǎn)過程和環(huán)境的兼容性好，能夠有效地降解樹脂成分，不影響產(chǎn)品質(zhì)量和設(shè)備的運行是紙漿樹脂障礙控制技術(shù)研究的熱點[6-8]?？梢杂糜诩垵{樹脂控制的生物酶主要包括：漆酶[9-12]、脂肪酶[13-14]、磷脂酶[15]、甾醇酯酶和脂氧合酶等[16]。其中，脂肪酶已廣泛應(yīng)用于控制高得率漿的樹脂障礙，但它主要是水解紙漿樹脂中的甘油酸酯，其應(yīng)用和效果有較大的局限性；甾醇酯酶的水解產(chǎn)物具有較強的黏性，仍然容易形成樹脂沉積，磷脂酶和脂氧合酶對紙漿中樹脂的水解和氧化效率較低，因此，這3類酶的研究較少。漆酶是一種含銅的多酚類氧化酶，可催化降解酚及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾醇及其衍生物、芳胺及其衍生物、金屬有機化合物等多類有機物[17-18]，是降解紙漿中樹脂的理想生物酶。由于漆酶的特異性比較強，大量的底物不能直接與之結(jié)合，通過漆酶的氧化還原電位比較低，不能直接作用于高氧化還原電勢的底物。研究發(fā)現(xiàn)，小分子介體是一些低相對分子質(zhì)量、低氧化還原電勢的化合物，容易得失電子，能在漆酶的作用下形成活性高且穩(wěn)定的中間體，并作用于各種底物。目前常用的漆酶介體分為人工合成介體和酚類天然介體兩大類，其中，人工合成介體(HBT、ABTS等)的研究較早較多，與漆酶形成的體系的氧化能力較強，但價格昂貴且具有潛在的毒性；酚類天然介體(丁香醛、乙酰丁香酮等)的來源廣泛，價格較低且與環(huán)境的兼容性好，但是體系的氧化能力相對較低，因此，研發(fā)高效、廉價、環(huán)保的介體是漆酶大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用急需解決的問題之一。本研究采用一種產(chǎn)自黃孢原毛平革菌的漆酶，對紙漿中的樹脂模擬物進行降解，重點篩選了該漆酶的介體，對比了漆酶/介體體系對單一樹脂模擬物(松香酸、亞油酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯)的降解率，探討了漆酶降解亞油酸和油酸的動力學(xué)，并優(yōu)化了漆酶/介體體系降解亞油酸的工藝條件，以期為紙漿樹脂障礙控制技術(shù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

漆酶，湖南鴻鷹生物科技有限公司，產(chǎn)自黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)的液體酶。實驗室測得該漆酶的酶活為850 U/mL，pH值4.0時其酶活最大。

亞油酸、油酸、松香酸、β-谷甾醇和甾醇油酸酯，均為標準品；丁香醛、乙酰丁香酮、醋酸鈉、冰醋酸和吡啶，均為分析純。2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1-羥基苯并三唑(HBT)，酷爾化學(xué)科技北京有限公司；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(98%干度)，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 漆酶/介體體系對樹脂模擬物的降解

1.2.1紙漿中樹脂模擬物溶液的制備 用丙酮為溶劑，分別加入亞油酸、松香酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯，配制成8 g/L樹脂模擬物/丙酮溶液；分別取一定量的樹脂模擬物/丙酮溶液，加入到pH值4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液中，用旋渦振蕩混合器混合，分別配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的紙漿樹脂模擬物。

1.2.2漆酶介體的篩選 分別用HBT、ABTS、丁香醛、乙酰丁香酮作為介體，在介體用量、酶用量、溫度、pH值和時間一定的條件下用漆酶處理亞油酸樹脂模擬物，反應(yīng)過程中用空氣泵向反應(yīng)液中充氧。分別用氣相色譜(GC)分析處理前和處理后的反應(yīng)液，用歸一化法計算亞油酸的峰面積[19]，用公式(1)計算亞油酸樹脂模擬物的降解率(y,%)，對比篩選出該漆酶合適的介體。

(1)

式中：C0—表示降解前樹脂的峰面積；C1—表示降解后樹脂的峰面積。

1.2.3對紙漿單一樹脂模擬物的降解 在酶用量、介體用量、時間、溫度、pH值一定和通空氣的條件下，用漆酶/介體體系分別處理松香酸、亞油酸、油酸、β-谷甾醇和甾醇油酸酯5種樹脂模擬物。分別用GC分析處理前和處理后的反應(yīng)液，用公式(1)計算出5種樹脂模擬物的降解率，并進行對比分析。

1.3 降解動力學(xué)研究

在酶用量、介體用量、時間、溫度、pH值一定和通空氣的條件下，用漆酶/介體體系分別處理亞油酸和油酸樹脂模擬物。改變2種底物的濃度，通過測定漆酶/介體體系在30 min內(nèi)對各個濃度的亞油酸和油酸樹脂模擬物的降解率，求出不同底物濃度下([S])酶解反應(yīng)初速度(v0)，然后以1/[S]為橫坐標、1/v0為縱坐標繪制Lineweaver-Burk圖，計算出漆酶與亞油酸和油酸反應(yīng)的米氏常數(shù)(Km)，并分析亞油酸和油酸的Km對其降解率的影響[20]。米氏方程可見式(2)：

(2)

式中：v0—反應(yīng)初速度，μmol/(min·L)；vmax—最大反應(yīng)速度，μmol/(min·L)；[S]—底物濃度，mmol/L；Km—米氏常數(shù)，mmol/L。

1.4 漆酶/介體體系降解亞油酸工藝優(yōu)化

在固定介體用量、pH值和通空氣的條件下，分別改變溫度、時間和酶用量，用漆酶/介體體系處理亞油酸樹脂模擬物，分別研究溫度、時間和酶用量對亞油酸降解效率的影響，確定漆酶/介體體系處理亞油酸的合適工藝條件。

1.5 分析與檢測

1.5.1漆酶酶活測定 采用ABTS法測定漆酶的酶活[21]。

1.5.2GC分析 首先對GC 分析的樣品進行硅烷化處理[22]，然后取1 mL樣品用7890 Plus氣相色譜儀(山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)進行分析。GC分析條件為SE-54石英毛細管柱(30 m×0.5 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器，進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度350 ℃；初始柱溫100 ℃保持1 min，然后以15 ℃/min 的速度升溫至280 ℃，保持30 min。

2 結(jié)果與討論

1)*:以亞油酸作樹脂模擬物linoleic acid as resin simulant；:介體為HBT HBT as mediator

2.1 漆酶介體的篩選

分別用HBT、ABTS、丁香醛、乙酰丁香酮作為介體，在介體用量7.6 mol/g(以樹脂模擬物的質(zhì)量計，下同)、酶用量2.0 U/mg、時間60 min、溫度50 ℃、pH值4.0和通空氣的條件下，用漆酶/介體體系處理亞油酸樹脂模擬物。同時，以漆酶單獨處理和煮沸滅活漆酶作為對照組，分別用GC分析4種漆酶/介體體系及2組對照組處理前和處理后的反應(yīng)液，用式(1)計算降解率，結(jié)果如表1所示。

表1 不同因素對漆酶降解樹脂模擬物的影響Table 1 Effect of different factors on the degradation of resin simulants by laccase

由表1可知，在漆酶被滅活的情況下，反應(yīng)前后亞油酸未被降解；在沒有添加介體時，漆酶單獨作用只能降解30.9%的亞油酸；而在反應(yīng)液中加入介體后，漆酶降解亞油酸的效率提高。這是因為漆酶是單電子氧化酶，其氧化還原電位低，氧化能力弱，而介體在漆酶的作用下會形成活性高且有一定穩(wěn)定性的中間體，這些中間體能從氧分子中獲得電子，并傳遞給底物，從而提高了系統(tǒng)的氧化還原電位，可加快反應(yīng)速度，提高底物降解效率，并且介體的加入可以進一步擴大氧化底物的范圍[11]。因為不同漆酶介體體系與底物的作用機制不同，使其氧化降解底物的效率存在差異[23]，在研究的4種介體中，漆酶/HBT體系處理亞油酸的降解率為88.9%，遠高于其他3種介體；漆酶/ABTS的體系對亞油酸的降解效率為46.8%，略高于2種天然介體體系丁香醛的45.1%和乙酰丁香酮的43.2%。因此，選擇HBT作為介體比較合適。

2.2 漆酶/HBT對樹脂模擬物的降解

在酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mol/g、時間60 min、溫度50 ℃、pH值4.0和通空氣的條件下，用漆酶/HBT體系分別處理松香酸、亞油酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯5種樹脂模擬物。5種樹脂模擬物處理前和處理后的GC-MS分析結(jié)果如圖1所示，漆酶/HBT體系對5種樹脂模擬物的降解率亦如表1所示。

1.處理前untreated；2.處理后treateda.松香酸abietic acid;b.亞油酸linoleic acid;c.油酸oleic aicd;d.β-谷甾醇β-sitosterol;e.甾醇油酸酯sterol oleate圖1 漆酶/HBT體系降解樹脂模擬物GC圖Fig.1 GC analysis of degradation pitch model compounds by laccase/HBT system

從表1可知，漆酶/HBT體系對松香酸、亞油酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯5種樹脂模擬物的降解率分別為100%、88.9%、81.5%、49.0%、33.6%，對松香酸的降解率最高，對不飽和脂肪酸的降解率次之，對甾醇和甾醇酯的降解率最低。從樹脂模擬物的分子結(jié)構(gòu)上分析，松香酸是一種三環(huán)二萜類化合物，含共軛雙健，其電子密度大，穩(wěn)定性差，易于與漆酶/HBT體系結(jié)合而被氧化降解，因此比亞油酸、β-谷甾醇等樹脂成分更容易被降解；而甾醇是一類由3個己烷環(huán)及1個戊烷環(huán)稠合而成的環(huán)戊烷多氫菲衍生物，穩(wěn)定性較好，更難與漆酶/介體體系結(jié)合，因此，β-谷甾醇和甾醇油酸酯難以被漆酶氧化。漆酶/HBT體系對底物降解效率的差異主要與其與漆酶/HBT體系結(jié)合的難易程度相關(guān)，底物越易于與介體自由基結(jié)合時，它就越容易被降解[23]。

亞油酸和油酸均含有不飽和雙鍵，比較容易被漆酶氧化降解。Zhang等[7]提出漆酶氧化亞油酸的過程，大致如下幾步(如圖2所示)：在漆酶的作用下，亞油酸C11上的H原子被提取，形成了自由基結(jié)構(gòu)，該自由基受到空氣中的氧原子攻擊，形成過氧自由基，然后，經(jīng)過一系列的鏈式反應(yīng)，H原子不斷被提取出來，形成氫過氧化物，最終形成醛、醇以及酮類物質(zhì)。

圖2 漆酶/HBT體系降解亞油酸反應(yīng)過程Fig.2 Mechanism of linoleic acid degradation by laccase/HBT system

2.3 亞油酸和油酸降解動力學(xué)

在酶用量1.0 U/mL、介體濃度3.8 mmol/L、時間30 min、溫度50 ℃、pH值4.0和通空氣條件下，用漆酶/HBT體系分別處理亞油酸和油酸。在底物濃度為0.59、1.19、1.77和2.36 mmol/L的條件下，分別測定了漆酶氧化亞油酸、油酸反應(yīng)的初速度(見表2)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法繪制曲線(見圖3)得到方程分別為：y=35.534 0x+2.583 6(R2=0.998 1)和y=37.278 6x+2.006 8(R2=0.998 9)。

表2 不同底物濃度下的反應(yīng)初速度Table 2 Initial reaction rate under differernt substrate concention

由圖3中Lineweaver-Burk圖的斜率和截距，可求出漆酶/HBT體系在底物為亞油酸、油酸條件下的米氏常數(shù)(Km)分別為1.38和1.86 mmol/L。Km值小，表示用很低的底物濃度即可達到最大的反應(yīng)速度的一半，說明酶與底物的親和力大，而酶與底物的親和力越大，酶促反應(yīng)越易進行，即亞油酸與漆酶/HBT體系的親和力比油酸更強，更易與漆酶介體體系結(jié)合而被降解。同時，2種底物的Km與制漿造紙生產(chǎn)過程漿水體系中樹脂的濃度0.17～1.82 mmol/L范圍吻合，生產(chǎn)過程中需根據(jù)漿水系統(tǒng)的樹脂成分和濃度、生產(chǎn)系統(tǒng)的溫度和pH值等條件和要求的不同對酶用量等工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

a.亞油酸linoleic acid；b.油酸oleic acid圖3 漆酶/HBT對不同底物的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.3 Lineweaver-Burk of laccase/HBT system of different substrates

2.4 漆酶/HBT降解亞油酸的工藝優(yōu)化

2.4.1溫度對降解率的影響 在酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mol/g、時間60 min、pH 值4.0和通空氣的條件下，探討了不同溫度對漆酶/HBT體系降解亞油酸的影響，結(jié)果如圖4(a)所示。

由圖4(a)可知，漆酶/HBT體系處理以亞油酸樹脂模擬物時，降解率隨溫度的升高先增加后降低，在溫度50 ℃時降解率達到最大值88.9%。因此，合適溫度為50 ℃。

2.4.2酶用量對降解率的影響 在HBT用量7.6 mol/g、時間60 min、溫度50 ℃、pH值4.0和通空氣的條件下，探討不同酶用量對漆酶/HBT體系降解亞油酸的影響，結(jié)果如圖4(b)所示。

由圖4(b)可知，樹脂模擬物亞油酸的降解率隨著漆酶酶用量的增加先快速提高，然后趨于平緩。當酶用量從0.5 U/mg增加至2.0 U/mg時，亞油酸的降解率從59.95%增加到88.9%，增加量大；當酶用量從2.0 U/mg繼續(xù)增加到4.0 U/mg時，亞油酸的降解率從88.9%增加到100%，亞油酸可以被漆酶完全降解。綜合考慮生產(chǎn)成本和降解效率，漆酶用量在2 U/mg比較合適。

2.4.3時間對降解率的影響 在酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mol/g、溫度50 ℃、pH值4.0和通空氣的條件下，探討不同反應(yīng)時間對漆酶/HBT體系降解亞油酸的影響，結(jié)果如圖4(c)所示。

由圖4(c)可見，隨著反應(yīng)時間的增加，亞油酸的降解率先迅速增加，隨后逐漸變慢。當反應(yīng)時間從15 min增加到60 min時，亞油酸的降解率從39.8%快速增加到88.9%；繼續(xù)延長反應(yīng)時間到120 min時，降解率從88.9%緩慢增加到100%，亞油酸完全被降解。因此，漆酶/HBT體系處理亞油酸的時間以60 min比較合適。

a.溫度temperature；b.酶用量enzyme dosage；c.時間time圖4 不同工藝條件對漆酶/HBT體系降解亞油酸效率的影響Fig.4 Effect of different conditions on degradation efficiency of linoleic acid by laccase/HBT system

3 結(jié) 論

3.1比較了漆酶與HBT、ABTS、丁香醛和乙酰丁香酮4種介體組成的漆酶/介體體系對亞油酸樹脂模擬物的降解效率，其中漆酶/HBT體系降解亞油酸的效率最高。

3.2漆酶/HBT體系對松香酸的降解率最高，對不飽和脂肪酸的降解率次之，對甾醇和甾醇酯的降解率最低。

3.3漆酶/HBT體系處理亞油酸、油酸的米氏常數(shù)分別為1.38和1.86 mmol/L，表明亞油酸更易與漆酶/HBT體系結(jié)合。

3.4用漆酶/HBT體系處理亞油酸的最佳處理條件為酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mmol/mg、時間60 min、溫度50 ℃、pH 值4.0，該條件下亞油酸的降解率為88.9%；當酶用量增加到4.0 U/mg或者處理時間延長至120 min，降解效率可達到100%。