鄧楚璇, 周英, 李上官, 劉星科, 王文娟, 李西, 孫凌霞, 羅春蘭, 李向, 黃玉梅*

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130；

2. 彭州市規(guī)劃和自然資源局，四川 彭州 611900

土壤是地球上大多數(shù)生物生存和發(fā)展的基礎(chǔ)載體，是地球表層系統(tǒng)中生物多樣性最豐富的生命層。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的一部分，是參與生物地球化學(xué)循環(huán)的重要動力，對維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、生態(tài)修復(fù)等具有一定作用[1-3]。細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多、分布最廣泛的微生物類群，在土壤生態(tài)過程中發(fā)揮重要的作用；真菌不僅與植物共生，也是有機物的重要分解者之一[3-5]。二者均是表征環(huán)境變化的敏感指標(biāo)，常用于預(yù)測土壤養(yǎng)分和環(huán)境質(zhì)量的變化[6]。大量研究證明土地利用方式是影響土壤微生物生物量及群落結(jié)構(gòu)的重要因子[7-8]。目前國內(nèi)外學(xué)者在微生物物種及結(jié)構(gòu)多樣性[9-11]、功能多樣性[12-13]、與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性方面研究較多[14-15]，多為同區(qū)域單一土地利用類型[11,13,15]或同區(qū)域少數(shù)土地利用類型的對比[9,16]，但欠缺對宏觀區(qū)域內(nèi)多種土地利用方式的研究[17]。

本研究基于Illumina MiSeq高通量測序平臺，對取自彭州市5種典型土地利用方式的土壤細(xì)菌和真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進行了探究，試圖探索土壤微生物在不同利用方式及土壤理化性質(zhì)下的群落結(jié)構(gòu)特征，提出土地利用結(jié)構(gòu)優(yōu)化措施，為探索可持續(xù)的土地利用方式提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

彭州市（103°10′—104°40′E，30°54′—31°29′N）位于四川省成都市西北部，地處成都平原與龍門山過渡地帶，屬中亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，氣候溫和，四季分明。年平均氣溫15.6 ℃，全年無霜期276 d，年平均降水量932.5 mm。地貌以山地、平原為主，土壤為砂巖發(fā)育而成的山地黃壤。地帶性森林植被類型為常綠闊葉林。

1.2 研究方法

1.2.1 樣地設(shè)置與樣品采集

2019年10月，分別在城市綠地（Urban Greenland，UL）、農(nóng)業(yè)用地（Farmland，F(xiàn)L）、人工林地（Plantation Woodland，PL）、灘涂地（Tidal Wetland，TL）、撂荒地（Abandoned Farmland，AL）生境下設(shè)置3個重復(fù)樣地，共15個固定樣地。樣地分布見圖1，生境概況見表1。取土前除去土壤表面的覆蓋物，用內(nèi)徑為5 cm的取樣器以“五梅花”形采集0～10 cm土壤樣品，去掉植物根系、石礫等雜物后充分混勻，用無菌袋盛裝并置于便攜式保鮮箱內(nèi)保存。將采集的土樣帶回實驗室，過2 mm篩后，一部分保存于?80 ℃的冰箱用于分子生物學(xué)研究，一部分于干燥常溫環(huán)境保存用于土壤理化性質(zhì)的測定。

1.2.2 土壤理化指標(biāo)測定

按照常規(guī)土壤農(nóng)化分析方法[18]測定土壤基本理化性質(zhì)，見表2。土壤容重（Bulk density，Bd）采用環(huán)刀法測定，土壤pH值（1：2.5）采用酸度計電位法，土壤含水率（Water content，Wc）采用烘干法測定。土壤銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）、速效磷（Available Phosphorus，AP）和速效鉀（Available Potassium，AK）用BSL-2C2土壤養(yǎng)分速測儀測定。

圖 1 樣地分布圖Fig. 1 Distribution map of sampling sites

表 1 土地利用方式基本概況Tab. 1 Basic characteristics of different land use types

表 2 不同土地利用方式下土壤理化特性Tab. 2 Physical and chemical characteristics of soil under different land use types

1.2.3 土壤微生物區(qū)系測定

采用 MP-bio 公司的 Fast DNA? SPIN Kit for Soil試劑盒提取土壤微生物基因組總DNA，用引物338F 和806R 擴增土壤細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)，用引物ITS1F 和ITS2R 擴增土壤真菌18S rRNA基因的ITS1區(qū)，基于Illumina MiSeq 測序平臺進行高通量測序。測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel2013處理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，SPSS24.0進行分析，GraphPad Prism5進行制圖。利用Mothur軟件計算土壤微生物的Shannon指數(shù)[19]、Simpson指數(shù)[20]、ACE指數(shù)[21]和Chao1指數(shù)[22]進行多樣性分析。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗（ɑ=0.05），分析得出不同生境土壤理化性質(zhì)、微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的差異。對土壤微生物多樣性指數(shù)和土壤理化性質(zhì)進行Pearson相關(guān)性分析，并采用冗余分析法（RDA）探明微生物群落對環(huán)境因子的響應(yīng)機制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土地利用方式細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

如圖2A，各生境土壤在門水平上的主要菌群如下：變形菌門（Proteobacteria，31.19%）、放線菌門（Actinobacteria，22.08%）、酸桿菌門（Acidobacteria，15.99%）、綠彎菌門（Chloroflexi，12.77%）、己科河菌門（Rokubacteria，3.6%）。其中，前4個菌門的相對豐度均大于10%，約占所有細(xì)菌的82%，是細(xì)菌中的優(yōu)勢菌門。由圖2A可知，變形菌相對豐度在農(nóng)業(yè)用地生境中最低（P<0.05）；且在灘涂地和撂荒地間存在顯著差異（P<0.05），但分別與城市綠地和人工林地?zé)o顯著差異。放線菌在城市綠地最高（P<0.05），農(nóng)業(yè)用地次之（P<0.05），人工林地最低（P<0.05），但灘涂地與撂荒地?zé)o顯著差異。綠彎菌在農(nóng)業(yè)用地生境中最高（P<0.05），灘涂地顯著高于城市綠地和人工林地（P<0.05），其余無顯著差異。酸桿菌在城市綠地和人工林地間差異顯著（P<0.05），其余不存在顯著差異。己科河菌在人工林地生境中最高（P<0.05），灘涂地與農(nóng)業(yè)用地、撂荒地差異顯著（P<0.05），但其他無顯著差異。

如圖2B，各生境土壤在目水平上的主要菌群如下：根瘤菌目（Rhizobiales，10.32%）、Subgroup_6菌目（8.15%）、β-變形菌目（Betaproteobacteriales，5.95%）、Gaiellales（4.74%）、Rokubacteriales菌目（3.56%）。由圖2B可知，除Subgroup_6菌外，其他4種細(xì)菌目在各生境下均有顯著差異。根瘤菌在農(nóng)業(yè)用地中最低（P<0.05），但人工林地與灘涂地，城市綠地與撂荒地間無顯著差異。β-變形菌在農(nóng)業(yè)用地生境中最低（P<0.05），但與人工林地?zé)o顯著差異；城市綠地與撂荒地存在顯著差異（P<0.05），其余無顯著差異。Gaiellales在農(nóng)業(yè)用地中分布較多（P<0.05），但與城市綠地?zé)o顯著差異；在灘涂地最低（P<0.05），其余差異不顯著。Rokubacteriales在人工林地最高、灘涂地最低（P<0.05），而城市綠地、農(nóng)業(yè)用地和撂荒地間無顯著差異。

2.2 不同土地利用方式細(xì)菌群落多樣性

對15個樣地的土壤樣品所得測序序列，以97%相似性閾值進行OTU聚類，共檢測到細(xì)菌群落7 422個OTU，分屬37門106綱278目491科959屬2 137種，15個樣地的細(xì)菌群落多樣性見表3。由表3可知，人工林地土壤細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)均與其他4種生境存在顯著差異（P<0.05）。其中，Shannon指數(shù)為最低值，Simpson指數(shù)為最大值，表明人工林地土壤的細(xì)菌群落多樣性最低。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，兩者均與群落豐富度呈正比。人工林地土壤的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均為最低值（見表3），表明人工林地土壤的細(xì)菌群落豐富度最低。灘涂地、撂荒地和城市綠地的多樣性與豐富度均較高。綜上，各生境下的土壤細(xì)菌群落多樣性與豐富度排序基本一致，表現(xiàn)為人工林地<農(nóng)業(yè)用地<撂荒地<灘涂地<城市綠地。

圖 2 不同土地利用方式下的土壤細(xì)菌群落組成Fig. 2 Composition of soil bacterial community under different land use types

2.3 不同土地利用方式真菌群落結(jié)構(gòu)特征

如圖3A，各生境土壤在門水平上的主要菌群如下：子囊菌門（Ascomycota，59.45%）、擔(dān)子菌門（ Basidiomycota， 15.61%）、 被 孢 霉 門（ Mortierellomycota， 15.24%）、 未 知 菌 門（ unclassified_k_Fungi， 7.86%）、 隱 真 菌 門（Rozellomycota，1.44%）。其中，優(yōu)勢真菌門是子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉門，約占所有真菌的90%。由圖3A可知，子囊菌和擔(dān)子菌的相對豐度在各生境分布無顯著差異，而被孢霉菌在農(nóng)業(yè)用地生境的相對豐度顯著高于其他生境（P<0.05），同時，其相對豐度在城市綠地與撂荒地間有顯著差異。未知菌門在人工林地與灘涂地生境中的相對豐度差異不顯著，但均高于其他生境（P<0.05）。隱真菌在人工林地生境中分布較多，顯著高于其他生境（P<0.05），而其他4種生境無顯著差異。

如圖3B，各生境土壤在目水平上的主要菌群如下：子囊菌門下目（unclassified_p_Ascomycota，16.00%）、被孢霉目（Mortierellales，15.21%）、肉座菌目（Hypocreales，14.97%）、未知菌目（unclassified_k_Fungi，7.86%）、絲孢酵母目（Trichosporonales，6.36%）。其中，優(yōu)勢真菌目是未分類子囊菌門下目、被孢霉目和肉座菌目，約占所有真菌目的46.18%。由圖3B可知，除肉座菌外，其他4種菌群在各生境分布均有顯著差異。未知子囊菌門下目的相對豐度在人工林地、灘涂地與撂荒地3種生境間無顯著差異，但均顯著高于農(nóng)業(yè)用地（P<0.05），且農(nóng)業(yè)用地與城市綠地有顯著差異（P<0.05）。被孢霉菌在農(nóng)業(yè)用地生境中分布較多，遠(yuǎn)高于其他生境（P<0.05），同時城市綠地與撂荒地存在顯著差異（P<0.05）。未知菌目在人工林地與灘涂地間無顯著差異，但均高于其他3種生境（P<0.05）。絲孢酵母目相對豐度在撂荒地最高（P<0.05），而在其他4種生境中分布較少。

圖 3 不同土地利用方式下的土壤真菌群落組成Fig. 3 Composition of soil fungal community under different land use types

2.4 不同土地利用方式真菌群落多樣性

對15個樣地的土壤樣品所得測序序列，以97%相似性閾值進行OTU聚類，共檢測到真菌群落5 360個OTU，分屬17門46綱118目295科627屬1 033種，15個樣地的真菌群落多樣性見表4。由表4可知，5種生境的土壤真菌群落多樣性指數(shù)均存在顯著差異。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在城市綠地與農(nóng)業(yè)用地間均存在顯著差異（P<0.05），同時Shannon指數(shù)在人工林地與撂荒地間存在顯著差異（P<0.05），其余差異不顯著。ACE和Chao1指數(shù)均表示豐富度，可知農(nóng)業(yè)用地的豐富度指數(shù)顯著低于其他生境（P<0.05），灘涂地最高（P<0.05），但與人工林地?zé)o顯著差異，同時城市綠地與人工林地、撂荒地差異不顯著。綜上，各生境下的土壤真菌群落多樣性表現(xiàn)為撂荒地<農(nóng)業(yè)用地<灘涂地<人工林地<城市綠地，豐富度表現(xiàn)為農(nóng)業(yè)用地<撂荒地<城市綠地<人工林地<灘涂地。雖各生境下的菌群多樣性與豐富度存在一定差異，但可以得知人工林地真菌群落多樣性和豐富度均較高，而農(nóng)業(yè)用地和撂荒地均較低。

表 4 不同土地利用方式下土壤真菌群落多樣性分析Tab. 4 Diversity analysis of soil fungal community under different land use types

2.5 環(huán)境因子對土壤微生物的影響

土壤微生物多樣性與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明，除Bd以外的各理化性質(zhì)均與細(xì)菌多樣性有顯著差異，且均與Shannon指數(shù)存在極顯著相關(guān)性（P<0.01），而真菌多樣性僅與pH存在顯著相關(guān)性（見表5）。Wc和AK均與細(xì)菌多樣性呈極顯著相關(guān)（P<0.01），其中，與Simpson指數(shù)呈正相關(guān)，與Shannon指數(shù)和豐富度指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。由表5可知，Wc、NH4+-N和AK是影響細(xì)菌群落多樣性和豐富度的關(guān)鍵性環(huán)境因素；pH是影響真菌群落多樣性的唯一環(huán)境因子，而各環(huán)境因子與豐富度指數(shù)的相關(guān)性均不強。

為揭示微生物群落與環(huán)境因子的關(guān)系，以門分類水平上的微生物群落作為響應(yīng)變量，土壤理化因子作為環(huán)境解釋變量進行了冗余分析（RDA）?？芍绊懠?xì)菌菌群組成的主要環(huán)境因子是pH、Wc、AK、Bd，而對真菌菌群影響較大的是pH、Bd（見圖4）。如圖4A，人工林地生境的己科河菌與AK、Wc、AP及NH4+-N均有顯著的正相關(guān)性，與Bd和pH呈負(fù)相關(guān)。撂荒地生境中除己科河菌之外的4種優(yōu)勢菌群均與pH呈正相關(guān)，變形菌與pH的相關(guān)性最強。農(nóng)業(yè)用地與除Bd以外的環(huán)境因子均呈負(fù)相關(guān)，而與Bd有一定正相關(guān)性。城市綠地的放線菌和綠彎菌與pH和Bd存在一定正相關(guān)。如圖4B，城市綠地、人工林地、灘涂地生境的子囊菌與pH、Wc和AK有一定正相關(guān)性，而與AP、NH4+-N呈負(fù)相關(guān)。農(nóng)業(yè)用地生境的被孢霉菌與NH4+-N呈正相關(guān)，與AK、Wc和pH負(fù)正相關(guān)。撂荒地生境的擔(dān)子菌與pH存在較強的正相關(guān)，且與Wc和AK有一定正相關(guān)性，但與Bd呈負(fù)相關(guān)。

表 5 土壤微生物多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Tab. 5 Correlation analysis between soil microbial diversity and environmental factors

圖 4 門水平上的土壤菌群與環(huán)境因子的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) of soil bacterial community at phyla level and environmental factors

3 討論

3.1 土地利用方式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征的影響

研究發(fā)現(xiàn)，5種生境土壤細(xì)菌群落主要為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門等類群，真菌群落包括子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉門等菌群。與多數(shù)研究結(jié)果基本一致[16,23-24]，但在相對豐度上存在一定差異。人工林地生境具有較高的酸桿菌豐度和較低的放線菌豐度，原因可能是杉木根系分泌的酚酸類物質(zhì)有利于部分酸桿菌菌群生長[25-26]，而對于森林凋落物的分解，放線菌主要參與半分解有機物的分解過程，前期由細(xì)菌和真菌主導(dǎo)[3,27]。城市綠地生境的酸桿菌豐度較低、變形菌較高。這與Fierer假說觀點吻合，由于研究樣地存在歷史較長，土壤生態(tài)環(huán)境漸趨穩(wěn)定，導(dǎo)致富營養(yǎng)型細(xì)菌（如變形菌門）豐度增加，寡營養(yǎng)型細(xì)菌（如酸桿菌門、綠彎菌門）相應(yīng)減少[28]。研究表明連作牡丹會導(dǎo)致其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，群落多樣性下降[29]。由于長期栽種同種作物，農(nóng)業(yè)用地土壤腐殖質(zhì)含量下降，導(dǎo)致耐貧瘠的微生物菌群增多，減少了富養(yǎng)型菌群多樣性，因此表現(xiàn)為變形菌豐度偏低、綠彎菌較高[17]。灘涂地生境具有較高的變形菌豐度，與多數(shù)研究結(jié)果[11,30]相吻合。本研究所有樣地的真菌中子囊菌占比最大，屬優(yōu)勢菌門。研究表明子囊菌門真菌多數(shù)為腐生菌，對降解土壤有機質(zhì)具有重要作用，同時也是土壤中主要的真菌分解者[24,31]。

3.2 土地利用方式對土壤微生物群落多樣性的影響

大量研究表明，土地利用方式是影響土壤質(zhì)量的關(guān)鍵因素，通過植被的多樣性和異質(zhì)性、管理措施的不同來影響土壤理化性質(zhì)，進而對土壤微生物多樣性及其組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[7,32]。微生物多樣性指數(shù)越高表明群落多樣性越高。本研究發(fā)現(xiàn)人工林地具有較低的細(xì)菌多樣性和較高的真菌多樣性。研究表明凋落物分解的不同時期可能形成不同的微生物群落結(jié)構(gòu)[27]。由于杉木枝葉殘體富含木質(zhì)素、纖維素等難分解有機物，前期易利用的凋落物被消耗后，主要由真菌進行后期木質(zhì)素含量高、質(zhì)量低的有機物分解活動[10,33]；同時土壤細(xì)菌和真菌是碎屑食物鏈的組成部分，土壤動物的牧食對兩種菌群的群落結(jié)構(gòu)也具有一定影響，本研究發(fā)現(xiàn)人工林地土壤動物豐度顯著高于其余幾種生境，這可能是導(dǎo)致人工林地細(xì)菌豐度及多樣性較低的原因之一。本研究中，城市綠地與灘涂地生境均具有較高的微生物多樣性。Huang等認(rèn)為城市土壤保持了豐富的地下生物群落[34]。由于城市綠地建成歷史較長，土壤理化結(jié)構(gòu)漸趨穩(wěn)定，且均為喬灌草復(fù)合型配置模式，具有較豐富的植物群落，土壤養(yǎng)分供給充足，有利于土壤微生物的活動。Gomez認(rèn)為土壤微生物的功能多樣性在自然植被條件下要高于植被擾動情況[35]。因灘涂地為自然形態(tài)，有一定的植被生物量和蓋度，有機質(zhì)積累豐富，同時干擾較少，因此表現(xiàn)出較高的微生物豐富度和多樣性[36]。同時，發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)用地生境的細(xì)菌、真菌均存在多樣性較低的現(xiàn)象，可能是由于源物質(zhì)回收處理致使土壤有機質(zhì)輸入減少，人為耕作管理方式破壞真菌菌絲生長，影響土壤團聚體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致微生物多樣性降低[12]。

3.3 土壤微生物與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

土壤微氣候環(huán)境是影響土壤微生物群落的關(guān)鍵因素，如土壤溫度、濕度、pH等，土壤養(yǎng)分作為微生物生存發(fā)展的必要營養(yǎng)元素，在土壤中的有效性也成為影響或制約土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)Ws、pH、NH4+-N、AK、AP 5種環(huán)境因子均對細(xì)菌群落多樣性有顯著影響，而與真菌群落多樣性顯著相關(guān)的僅pH。大量研究認(rèn)為植被類型與土壤特性是影響微生物的重要因素[32]，細(xì)菌與土壤性質(zhì)的相關(guān)性更強，而真菌與植物群落的關(guān)系更密切[24,39]。同時，土壤pH與細(xì)菌多樣性呈正相關(guān)，與真菌呈負(fù)相關(guān)，真菌相比細(xì)菌更偏好在酸性土壤環(huán)境中生存，這與大多數(shù)研究結(jié)果吻合[10,24,40]，原因可能與微生物對pH的選擇性適應(yīng)有關(guān)。pH對細(xì)菌與真菌的群落組成也有重要影響。pH與除己科河菌外的4種優(yōu)勢細(xì)菌門均存在正相關(guān)性，證實了大部分細(xì)菌適宜在pH值較高的土壤中生存。Bd可影響土壤透氣性、水分及其有效性，進而影響到微生物生命活動[41]。研究發(fā)現(xiàn)放線菌、綠彎菌和被孢霉菌與Bd存在一定正相關(guān)，表明3種菌群具有較強的生態(tài)適應(yīng)性。己科河菌與AK、AP、NH4+-N、Ws存在正相關(guān)，反映了己科河菌對于養(yǎng)分豐富的土壤環(huán)境的偏好。由于子囊菌和擔(dān)子菌偏好通氣性好的土壤條件，是土壤有機質(zhì)的主要分解者[42]，因此其與Ws、AK呈正相關(guān)，與Bd負(fù)相關(guān)，與烏拉山油松根際真菌群落結(jié)構(gòu)[14]的研究結(jié)果一致。綜上，土壤pH是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、組成和多樣性的主要作用因子，與多數(shù)研究結(jié)果一致[16,23,37]。

4 結(jié)論

土地利用方式影響土壤理化性質(zhì)及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，土壤微生物變化對生態(tài)環(huán)境具有重要的指示作用，土壤pH可作為預(yù)測微生物群落變化和土壤質(zhì)量的指標(biāo)之一。本研究區(qū)內(nèi)微生物多樣性較高的生境是城市綠地與灘涂地，一改人們對城市建成區(qū)破壞嚴(yán)重、環(huán)境惡化的固有印象，而灘涂地自然化高、受人為影響較少。這兩種生境均為土壤微生物的活動提供了較好的棲息環(huán)境，對提升微生物多樣性、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性有著突出的作用，應(yīng)重視并維護好此類土地的發(fā)展。人工杉木林連栽及農(nóng)作物連作均會導(dǎo)致土壤微生物多樣性下降，必須摒棄不合理的營林模式和農(nóng)耕模式，優(yōu)化資源利用方式。