韓 瑞，楊艷麗，師偉偉，郝成武，賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆 烏魯木齊 830032）

病毒類產(chǎn)品已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用于疫苗、基因治療、癌癥治療等領(lǐng)域。由于其尺寸大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差的特殊結(jié)構(gòu)特征，病毒類生物制品的制備過(guò)程相比單體蛋白更具有挑戰(zhàn)性。在病毒類生物制品開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，病毒的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要。病毒的定量方法可以分為四類：（1）測(cè)定病毒的感染水平；（2）檢測(cè)病毒功能性的結(jié)構(gòu)蛋白；（3）檢測(cè)病毒基因組核酸或標(biāo)記核酸；4）對(duì)病毒顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)。測(cè)定病毒感染水平是傳統(tǒng)的病毒定量方法，例如空斑形成單位（PFU）、50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）、以及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。然而這類檢測(cè)方法往往檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且只能對(duì)具有感染活性的病毒進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法滿足滅活后病毒的測(cè)定需要?？贵w技術(shù)的發(fā)展使得病毒測(cè)定的特異性和靈敏度都有顯著提升。但酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）無(wú)法區(qū)分完整病毒與降解產(chǎn)物，且是否有合適的抗體是ELISA方法準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和基于結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)大大提高了病毒的檢測(cè)速度和準(zhǔn)確性。近年來(lái)，逐漸出現(xiàn)了一些新的技術(shù)，已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于病毒的分析和定量檢測(cè)中。這些技術(shù)檢測(cè)速度快，并提供更多的病毒信息。本文就近年來(lái)出現(xiàn)的病毒定量檢測(cè)新技術(shù)，尤其是基于分離和病毒顆粒計(jì)數(shù)定量的新技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)行介紹，并對(duì)這些新技術(shù)在獸用疫苗開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用作了進(jìn)一步展望。

1 基于病毒核酸定量的液滴數(shù)字PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法（RT-qPCR）是能夠定量檢測(cè)病毒目的基因擴(kuò)增數(shù)量的PCR技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)展成為廣泛用于多種病毒檢測(cè)的技術(shù)，具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。液滴數(shù)字PCR（ddPCR）是在RT-qPCR基礎(chǔ)上發(fā)展出的新技術(shù)。兩種PCR的原理都是在PCR體系中加入熒光染料或熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合并被激發(fā)產(chǎn)生熒光，通過(guò)熒光信號(hào)探測(cè)器監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)測(cè)定目的基因的拷貝數(shù)量，反映病毒含量。二者的區(qū)別主要在于對(duì)基因拷貝絕對(duì)值的定量方法。常規(guī)RT-qPCR的定量需要采用參照基因的質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋不同濃度后分別作為模板進(jìn)行PCR，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和拷貝數(shù)來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將病毒樣品所測(cè)得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得相應(yīng)拷貝數(shù)，因此定量結(jié)果在很大程度上取決于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量。而ddPCR檢測(cè)主要采用微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至儀器的微反應(yīng)器或微滴中，使每個(gè)反應(yīng)器中只存在1個(gè)或0個(gè)核酸模板。經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，含有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器則沒(méi)有熒光信號(hào)。進(jìn)一步根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，可以推算出原始溶液中的核酸拷貝數(shù)。目前ddPCR已經(jīng)被報(bào)道用于口蹄疫病毒（FMDV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、新型冠狀病毒等的定量。與RT-qPCR比較，ddPCR具有更高的準(zhǔn)確度、靈敏度和重現(xiàn)性，并可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量。在采用PCR定量檢測(cè)時(shí)，引物的設(shè)計(jì)，以及RNA病毒的核酸的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程都需要一定的優(yōu)化和考量，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，由于測(cè)得的病毒核酸不一定是病毒顆粒的一部分，可能會(huì)大大高估存在的病毒數(shù)。

2 基于分離技術(shù)的定量方法

2.1 高效尺寸排阻色譜法

高效尺寸排阻色譜（HPSEC）是一種基于尺寸大小分離分子的一種非破壞性技術(shù)。HPSEC的色譜基質(zhì)具有孔穴結(jié)構(gòu)，尺寸大的分子不能滲透到基質(zhì)孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來(lái)；而小分子可完全滲透入內(nèi)，最后流出色譜柱。HPSEC根據(jù)被分離物質(zhì)的紫外吸收峰面積，對(duì)照濃度校正曲線進(jìn)行定量測(cè)定。通過(guò)選擇不同孔徑大小的色譜基質(zhì)，HPSEC可以實(shí)現(xiàn)不同的分離測(cè)定。幾十年來(lái)，HPSEC已經(jīng)成為分析抗體等尺寸較小的蛋白質(zhì)的常用方法，但在病毒的檢測(cè)中應(yīng)用相對(duì)較少，主要障礙在于HPSEC基質(zhì)的孔徑大小有限，而病毒的尺寸較大，往往會(huì)在外水體積被淋洗出來(lái)。然而，隨著色譜填料制備技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已有基質(zhì)孔徑大于100nm的商業(yè)分析柱，從而可以分析大多數(shù)大型病毒、病毒樣顆粒，以及10～100nm范圍內(nèi)的聚集體。

目前HPSEC方法已經(jīng)成功用于FMDV、流感病毒、慢病毒等的定量檢測(cè)。利用HPSEC定量檢測(cè)滅活FMDV，可以在30 min內(nèi)選擇性地檢測(cè)完整病毒146S，具有很好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。HPSEC不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)FMDV的定量，并能給出純度信息，用于快速篩選純化工藝條件。使用HPSEC定量評(píng)估146S的解離率，實(shí)現(xiàn)了抗原穩(wěn)定劑的篩選。此外，HPSEC還可與多角度激光光散射（MALLS）探測(cè)器耦合，獲得更多病毒信息。MALLS檢測(cè)器不僅能給出HPSEC不同吸收峰物質(zhì)的平均摩爾質(zhì)量和平均尺寸，還可計(jì)算顆粒數(shù)量實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒進(jìn)行定量，而無(wú)需校準(zhǔn)曲線。HPLC設(shè)備的普及、簡(jiǎn)單和自動(dòng)化操作以及HPSEC各種規(guī)格的分析柱使其對(duì)研究機(jī)構(gòu)、制藥公司和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)或質(zhì)量監(jiān)控非常有吸引力。

2.2 非對(duì)稱場(chǎng)流分級(jí)

非對(duì)稱流場(chǎng)流動(dòng)分級(jí)（AF4）是適用于表征納米和微米系統(tǒng)的分離技術(shù)。與HPSEC不同，AF4不需要分離基質(zhì)，而是將病毒等樣品進(jìn)樣至一個(gè)底部為多孔膜的、有連續(xù)流的狹窄通道。通過(guò)水平方向和垂直方向上的力，在層流方向產(chǎn)生一個(gè)拋物線的流速曲線，中間的流速最快，通道的邊緣流速最慢。這種形式使得小分子比大分子先洗脫。相比HPSEC，AF4檢測(cè)更加無(wú)損生物樣品結(jié)構(gòu)。通過(guò)調(diào)整進(jìn)樣的時(shí)間，層流流速及外場(chǎng)力的大小等參數(shù)，AF4可以在很寬的尺寸范圍內(nèi)分離分子（103～109Da；粒徑從2nm～0.5～1μm），因此特別適合病毒和聚集體的分析。AF4除了根據(jù)分離樣品的紫外吸收峰面積定量，同樣可與MALLS聯(lián)用，對(duì)顆粒數(shù)進(jìn)測(cè)定實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒顆粒的定量。Tatiana等采用AF4-MALLS對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的流感病毒進(jìn)行定量測(cè)定，具有很好的重復(fù)性，RSD為1.9%。與其他技術(shù)包括HPSEC-MALLS、q-PCR、TCID50等比較，結(jié)果具有可比性，證明AF4-MALLS是檢測(cè)流感病毒的一種可靠技術(shù)，具有靈敏度和重復(fù)性。與此同時(shí)，由于AF4的操作靈活性，對(duì)操作人員的專業(yè)要求也更高。

2.3 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳（CE）是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品組分之間電泳淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的新型液相分離技術(shù)。其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）根據(jù)物質(zhì)在緩沖溶液中表現(xiàn)的荷質(zhì)比產(chǎn)生不同的電遷移速率從而進(jìn)行分離，在具有大尺寸的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、病毒、病毒樣顆粒、脂質(zhì)體的分析上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

CZE已被報(bào)道分離和測(cè)定脊髓灰質(zhì)炎病毒、人鼻病毒（HRV），并能區(qū)分不同血清型的HRV和甲型流感病毒。相比其它檢測(cè)方法，CZE具有檢測(cè)速度快的優(yōu)勢(shì)。Tricht等采用CZE對(duì)不同生產(chǎn)過(guò)程中的腺病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，單個(gè)樣品的總運(yùn)行時(shí)間最快在5min以內(nèi)，30個(gè)樣品的總運(yùn)行時(shí)間少于4h，而RT-qPCR為3d。在優(yōu)化CZE毛細(xì)管類型和緩沖液組成后，CZE方法的定量精密度小于5%RSD，準(zhǔn)確度為90%～110%，測(cè)定結(jié)果與RT-qPCR等其他方法相當(dāng)。CZE近期被報(bào)道能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多價(jià)FMDV疫苗中不同血清型的病毒146S分別定量測(cè)定。經(jīng)分析，F(xiàn)MDV A型與O型抗原存在較大的電荷差異，在CZE中具有不同的保留時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)良好的分離并能分別定量。而超速離心法與HPSEC均無(wú)法區(qū)分尺寸相近的兩種血清型病毒，因此只能得出總病毒含量。與ELISA方法相比，ELISA難以完全區(qū)分完整病毒與亞病毒顆粒，而CZE根據(jù)病毒的特征峰可將其與亞病毒顆粒區(qū)分開(kāi)。以上報(bào)道顯示了CE在病毒定量檢測(cè)方面的潛力。

3 基于顆粒計(jì)數(shù)的定量方法

3.1 納米粒子跟蹤分析

納米顆粒跟蹤分析（NTA）是利用粒子光散射特性的一種非侵入式和非分離檢測(cè)技術(shù)，可簡(jiǎn)單、快速地表征直徑30～1000 nm的顆粒的尺寸分布和數(shù)量密度。其原理是通過(guò)顯微鏡和電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)，捕獲視野內(nèi)每個(gè)粒子的布朗運(yùn)動(dòng)隨時(shí)間的函數(shù)分布圖，然后將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)榱Ｗ拥牧黧w動(dòng)力直徑和粒子濃度。操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快是NTA的優(yōu)勢(shì)。由于NTA方法同時(shí)測(cè)量單個(gè)粒子，因此最快可以在5 min內(nèi)完成檢測(cè)。NTA已經(jīng)應(yīng)用于慢病毒、外泌體、腺病毒、流感病毒的定量檢測(cè)。相比其它顆粒檢測(cè)技術(shù)，NTA在定量分析的同時(shí)，還可分析所得樣品的尺寸分布，提供更多病毒信息。需要注意的是，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，NTA檢測(cè)過(guò)程中需要保持顆粒數(shù)在107～109VP/mL。與HPSEC-M ALL相比，NTA對(duì)多分散樣品，例如未經(jīng)純化的病毒樣品的表征準(zhǔn)確性較差。采用熒光NTA可提高對(duì)病毒測(cè)定的選擇性。Szakacs等通過(guò)熒光標(biāo)記的病毒特異性受體對(duì)病毒進(jìn)行熒光標(biāo)記，定量分析了人類呼吸道合胞病毒（RSV）。

3.2 病毒計(jì)數(shù)儀

病毒計(jì)數(shù)儀（VC）是一種類似流式細(xì)胞儀，適用于液體樣本中的病毒定量的設(shè)備，由美國(guó)ViroCyt公司開(kāi)發(fā)。其原理是采用兩種不同的熒光染料分別對(duì)病毒的蛋白質(zhì)及核酸進(jìn)行染色。染色后的病毒通過(guò)檢測(cè)室時(shí)，被激光激發(fā)，被標(biāo)記的蛋白與核酸分別產(chǎn)生相應(yīng)熒光信號(hào)。通過(guò)對(duì)同時(shí)具有蛋白與核酸熒光信號(hào)的病毒顆粒計(jì)數(shù)進(jìn)行定量。該檢測(cè)技術(shù)具有分析速度快，樣品制備簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過(guò)30min左右的染色，VC可在10min之內(nèi)，最短5min完成對(duì)帶有熒光染料的病毒顆粒分析。VC檢測(cè)要求病毒尺寸大于25nm，以保證足夠的檢測(cè)信號(hào)和可靠的結(jié)果。其可靠的測(cè)量范圍是5×105～1×109VP/mL。Stepp等采用VC對(duì)一系列病毒包括腺病毒、桿狀病毒、冠狀病毒、單純皰疹病毒等進(jìn)行定量測(cè)定，并將結(jié)果與TCID50、透射電鏡（TEM）進(jìn)行比較，具有較好的相關(guān)性。楊小蓉等采用了VC對(duì)滅活FMDV疫苗的146S進(jìn)行定量測(cè)定，變異系數(shù)為1.15%～3.57%，表明結(jié)果有較好的重復(fù)性。作者進(jìn)一步將VC檢測(cè)結(jié)果與超速離心方法進(jìn)行比較，結(jié)果略有差異但具有一致性，且VC極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間。

3.3 可調(diào)電阻式脈沖傳感

可調(diào)電阻式脈沖傳感(TRPS)是Izon公司開(kāi)發(fā)的一種實(shí)時(shí)的納米顆粒分析技術(shù)，能夠測(cè)量尺寸范圍從60nm～2μm納米粒子，適合尺寸較大的病毒分析。對(duì)病毒類產(chǎn)品的檢測(cè)不僅包括純度分析和定量，最理想的情況下是實(shí)時(shí)獲得更多的病毒性質(zhì)參數(shù)，比如尺寸分布、電荷性、濃度等。TRPS相比其它病毒定量方法，不僅能測(cè)得病毒的顆粒數(shù)，并能給出樣品的粒度分布并同時(shí)測(cè)定zeta電位，闡明樣品的電荷性質(zhì)。這項(xiàng)技術(shù)基于庫(kù)爾特原理，采用具有一個(gè)可調(diào)節(jié)孔隙的納米孔，當(dāng)充滿電解液的納米孔上下兩邊施加一定的電壓時(shí)，納米孔內(nèi)會(huì)產(chǎn)生離子電流。當(dāng)樣品中的分子依次通過(guò)納米孔時(shí)，會(huì)產(chǎn)生電阻脈沖信號(hào)，分子流速與其濃度成正比，所以可以準(zhǔn)確測(cè)定不同尺寸的顆粒濃度；該脈沖信號(hào)大小與顆粒的體積成正比，因此可以逐個(gè)測(cè)得每個(gè)顆粒的尺寸。與此同時(shí)，通過(guò)分析單個(gè)顆粒在不同驅(qū)動(dòng)力下電阻式脈沖的持續(xù)時(shí)間，跟已知尺寸、表面電荷和個(gè)數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，可逐個(gè)測(cè)定顆粒的表面電荷。

TRPS已經(jīng)被用于定量分子慢病毒和輪狀病毒等。Ikeda等使用TRPS定量測(cè)定了慢病毒載體。結(jié)果表明，TRPS所測(cè)得的顆粒濃度（7.99×1010VP/mL）明顯高于病毒滴度（1.08×106VP/mL），但低于RT-qPCR法（2.33×1012VP/mL）。這一結(jié)果也表明不同的病毒定量檢測(cè)方法之間結(jié)果比較的困難。由于慢病毒滴度檢測(cè)受病毒載體及檢測(cè)參數(shù)的影響，不同實(shí)驗(yàn)室及操作方法的檢測(cè)結(jié)果實(shí)際上難以互相比較。但基于顆粒分析的技術(shù)確實(shí)有可能受細(xì)胞碎片等干擾物的影響而過(guò)高的估計(jì)了病毒數(shù)量。因此研究者提出經(jīng)過(guò)一定分離方法去除干擾性的雜質(zhì)后，獲得的結(jié)果更加準(zhǔn)確。Heider等在TRPS檢測(cè)前通過(guò)SEC去除部分雜質(zhì)，再分析慢病毒載體的濃度，并通過(guò)顆粒大小和表面電荷遷移率表征慢病毒載體制劑，用于監(jiān)測(cè)病毒的生產(chǎn)和純化。TRPS的結(jié)果不僅檢測(cè)到了SEC不同收集組分中的顆粒濃度，還對(duì)所收集顆粒的尺寸分布進(jìn)行了分析，得到的平均尺寸與NTA的結(jié)果具有一致性。通過(guò)比較不同種類病毒產(chǎn)品的電荷遷移率，可以反映病毒的表面化學(xué)性質(zhì)的改變，因此TRPS可以進(jìn)一步發(fā)展為鑒定不同病毒類型或狀態(tài)的工具。

4 總結(jié)與展望

病毒的定量檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)病毒類生物制品的研發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義。目前已有多種基于不同原理的病毒定量檢測(cè)技術(shù)。正是由于檢測(cè)原理不同，不同的定量檢測(cè)方法之間往往存在較大差異。例如感染性滴度與總病毒數(shù)的結(jié)果絕對(duì)值相差可達(dá)10~1000倍。不同的檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此在建立病毒定量方法時(shí)，需要基于多個(gè)因素進(jìn)行評(píng)估，包括對(duì)病毒性質(zhì)的關(guān)注點(diǎn)，樣品純度及濃度，方法的準(zhǔn)確性、檢測(cè)速度，儀器成本，方法的可得性等，選擇適合本產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)。值得關(guān)注的是，本文介紹的新技術(shù)不僅已經(jīng)在人用疫苗和基因治療產(chǎn)品的研發(fā)中得到應(yīng)用，ddPCR、HPSEC、VC、CZE等方法也已經(jīng)在獸用疫苗的檢測(cè)中嶄露頭角。相信隨著國(guó)內(nèi)獸用疫苗研發(fā)和生產(chǎn)水平的提高，這些新技術(shù)會(huì)越來(lái)越多的在提升疫苗質(zhì)量中發(fā)揮作用。