高東菊 張鳳娥 孔德穎 鮑文敏 張微微

(上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海，201699) (上海市農(nóng)業(yè)學(xué)校) (上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

重金屬污染是當前全球的生態(tài)危機，給農(nóng)業(yè)和園林綠化都帶來了很大的影響。重金屬脅迫是全球普遍存在的一種非生物脅迫，是限制植物生長和發(fā)育的主要環(huán)境因素之一。重金屬進入土壤中，不僅不能被土壤微生物分解，而且易于形成有毒物質(zhì)并積累，打破土壤中各種營養(yǎng)元素的比例平衡，對植物生長發(fā)育造成損害。據(jù)研究統(tǒng)計，我國耕地面積的五分之一，約2 000萬hm2都不同程度被重金屬污染[1]，每年有1 200萬t農(nóng)作物被重金屬污染[2]，不僅僅造成糧食的浪費，而且給人類的健康帶來潛在危險。

銅是常見的重金屬元素，也是植物生長過程中必需的微量元素。銅參與植物體內(nèi)多種生理生化代謝過程，與植物的生長發(fā)育及繁殖息息相關(guān)[3]。如植物體內(nèi)積累過量的銅，其光合作用會受到抑制、破壞植物體中的離子平衡，導(dǎo)致植物生理紊亂，進而引起銅毒害[4]。鉛作為重金屬污染成分之一，被植物通過土壤及降水吸收，進入系統(tǒng)內(nèi)部循環(huán)[5]。相關(guān)研究表明，過量的鉛會影響植物根細胞的有絲分裂速度，增加植物吸水量及耗氧量[6-7]，進而影響植物的生長發(fā)育。因此，探究植物在銅、鉛脅迫時的適應(yīng)范圍、響應(yīng)機制，篩選出對重金屬脅迫環(huán)境適應(yīng)性較強的植物，對環(huán)境修復(fù)和園林綠化具有重要意義。

鳳尾雞冠花(Celosiaplumosa)為莧科(Amaranthaceae)青葙屬(Celosia)1年生草本植物，原產(chǎn)印度；其花穗豐滿、形似火炬、花色豐富、花期較長，是夏秋兩季的常見觀賞花卉，可布置花壇、花境和做基礎(chǔ)栽植。目前關(guān)于雞冠花的研究，主要在雜交育種和規(guī)?；a(chǎn)、鹽脅迫等方面[8-9]，該種植物對重金屬脅迫的相關(guān)研究較少。本文以鳳尾雞冠花的2個品種‘和服’、‘紅塔山’的種子為對象，研究重金屬銅、鉛對其種子萌發(fā)的影響，探討2種鳳尾雞冠花的種子重金屬脅迫適應(yīng)范圍，旨在為重金屬土壤污染修復(fù)和擴大鳳尾雞冠花的園林應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

試驗于2019年5月份在上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院實驗室進行。供試的‘和服’、‘紅塔山’鳳尾雞冠花種子，購買于北京花仙子花卉公司。Cu2+、Pb2+溶液分別以分析純的CuSO4·5H2O、Pb(NO3)2配制，試驗設(shè)計的2種重金屬處理液質(zhì)量濃度梯度一致，依次為50、200、350、500 mg/L。

重金屬脅迫處理方法：采用紙上發(fā)芽的方法進行種子萌發(fā)脅迫試驗。在培養(yǎng)皿中加入配制好的重金屬溶液，隨機且均勻擺放30粒種子，保證每個培養(yǎng)皿中加入等量的重金屬溶液，蓋好皿蓋放在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。每個處理設(shè)3個重復(fù)，以等量的蒸餾水處理為對照。每個培養(yǎng)皿中，除了溶液不同，保持其他因素一致。每天定時觀察種子的發(fā)芽情況，以胚根突破種皮的長度超過2 mm作為發(fā)芽的標準，直到種子不再萌發(fā)或處于低水平萌發(fā)為止。

根據(jù)各處理種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)，計算種子耐金屬脅迫的適宜處理液質(zhì)量濃度、半致死處理液質(zhì)量濃度、極限處理液質(zhì)量濃度。

發(fā)芽率=(正常發(fā)芽的種子數(shù)/供檢種子總量)×100%；相對發(fā)芽率=(發(fā)芽率/對照發(fā)芽率)×100%；發(fā)芽勢=(發(fā)芽種子數(shù)達到高峰時正常發(fā)芽種子總數(shù)/供檢種子總數(shù))×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑Nt/Tt(Nt為不同時間當天的發(fā)芽數(shù)，Tt為相應(yīng)的發(fā)芽試驗時間(以天計))。

種子耐金屬脅迫適宜范圍，為發(fā)芽率達到對照發(fā)芽率75%時相對應(yīng)的重金屬溶液質(zhì)量濃度；半致死處理液質(zhì)量濃度，為發(fā)芽率達到對照發(fā)芽率的50%的重金屬溶液質(zhì)量濃度；極限處理液質(zhì)量濃度，為發(fā)芽率達到對照發(fā)芽率的10%的重金屬溶液質(zhì)量濃度。

復(fù)水處理：待種子發(fā)芽數(shù)不再發(fā)生變化時，將各處理未發(fā)芽的種子用清水清洗3次，放入新的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。每天定時觀察記錄種子萌發(fā)情況，萌發(fā)恢復(fù)率=(復(fù)水后種子萌發(fā)的總數(shù)/重金屬脅迫中未萌發(fā)的種子數(shù))×100%。

胚根長度觀測：在種子已經(jīng)不再發(fā)芽或者處于低水平發(fā)芽時，在已經(jīng)發(fā)芽的各處理中隨機選擇10粒種子，測量出每個胚根的長度。

數(shù)據(jù)分析：采用DPS(數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))統(tǒng)計分析進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+、Pb2+脅迫對2個鳳尾雞冠花品種種子萌發(fā)力的影響

由表1可見：不同質(zhì)量濃度的Cu2+對2個鳳尾雞冠花品種的種子萌發(fā)影響情況相似。隨著Cu2+溶液質(zhì)量濃度的升高，2個鳳尾雞冠花品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢。其中：‘和服’的發(fā)芽率，在處理液質(zhì)量濃度為50 mg/L脅迫時，與對照差異顯著(P<0.05)；在處理液質(zhì)量濃度為200 mg/L時，發(fā)芽率為對照的78.7%；在處理液質(zhì)量濃度為500 mg/L時，發(fā)芽率僅為對照的70.0%；說明不同質(zhì)量濃度的Cu2+，均顯著抑制了‘和服’種子的萌發(fā)。發(fā)芽勢的數(shù)據(jù)顯示，Cu2+質(zhì)量濃度達到200～350 mg/L時，‘和服’的發(fā)芽勢下降極為顯著(P<0.05)，之后略有下降，下降程度不顯著。

‘紅塔山’的常規(guī)發(fā)芽率比‘和服’稍低，且處理液質(zhì)量濃度50 mg/L的Cu2+對其影響不顯著，其余Cu2+質(zhì)量濃度對其發(fā)芽率影響顯著(P<0.05)。處理液質(zhì)量濃度為350 mg/L時，其發(fā)芽率下降15.1%；處理液質(zhì)量濃度為500 mg/L時，仍有所下降，但下降程度不顯著。發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)的結(jié)果與發(fā)芽率類似，抑制強弱與Cu2+溶液質(zhì)量濃度有關(guān)。

表1 Cu2+脅迫2個鳳尾雞冠花品種種子萌發(fā)狀況

將Cu2+脅迫時種子發(fā)芽率與Cu2+質(zhì)量濃度作相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，2種鳳尾雞冠花的Cu2+溶液質(zhì)量濃度與萌發(fā)率均呈顯著負相關(guān)(見表2)。

表2 2個鳳尾雞冠花品種種子耐Cu2+溶液質(zhì)量濃度范圍

由表3可見：Pb2+對2個鳳尾雞冠花品種種子的萌發(fā)影響與Cu2+的影響有所差異。主要表現(xiàn)為，Pb2+處理液質(zhì)量濃度為50 mg/L時，2品種的種子發(fā)芽率比對照均有所上升，尤其是‘紅塔山’種子發(fā)芽率顯著高于對照；Pb2+處理液質(zhì)量濃度為200 mg/L時，‘紅塔山’種子發(fā)芽率有小幅提高，但與對照差異不顯著。其他Pb2+處理液質(zhì)量濃度處理，則會抑制種子的萌發(fā)，且隨著Pb2+處理液質(zhì)量濃度的增加，抑制作用增強。發(fā)芽勢數(shù)據(jù)同樣表明，Pb2+處理液質(zhì)量濃度為50 mg/L時，2個鳳尾雞冠花品種的種子萌發(fā)整齊度比對照更高，說明低質(zhì)量濃度的鉛處理對2種鳳尾雞冠花種子的萌發(fā)有一定的促進作用，高質(zhì)量濃度的鉛處理會抑制種子的萌發(fā)，表現(xiàn)為低促高抑。

表3 Pb2+脅迫2個鳳尾雞冠花品種種子萌發(fā)狀況

將Pb2+脅迫時種子發(fā)芽率與Pb2+質(zhì)量濃度作相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，‘和服’鳳尾雞冠花的Pb2+溶液質(zhì)量濃度與萌發(fā)率呈顯著負相關(guān)，但‘紅塔山’鳳尾雞冠花的Pb2+溶液質(zhì)量濃度與萌發(fā)率未達顯著水平(見表4)。

表4 2個鳳尾雞冠花品種種子耐Pb2+溶液質(zhì)量濃度范圍

2.2 Cu2+、Pb2+脅迫對2鳳尾雞冠花品種種子發(fā)芽進程的影響

由圖1～圖4可見：Cu2+、Pb2+處理的‘和服’、‘紅塔山’鳳尾雞冠花種子與對照的發(fā)芽進程基本一致，均是多數(shù)種子迅速萌發(fā)而后進入緩慢增加的狀態(tài)，即置種后第1天開始萌發(fā)且當天發(fā)芽數(shù)最多，開始萌發(fā)后的2～4 d處于緩慢萌發(fā)水平，5～7 d種子萌發(fā)數(shù)達到一個峰值后發(fā)芽率基本保持不變。Cu2+、Pb2+脅迫沒有推遲種子開始萌發(fā)時間，但推遲了累計發(fā)芽率達到高峰時間。對照在置種后第4天達到發(fā)芽高峰，質(zhì)量濃度50、200 mg/L的Cu2+脅迫時，‘和服’、‘紅塔山’種子的發(fā)芽高峰推遲1 d；質(zhì)量濃度350、500 mg/L的Cu2+脅迫時，‘和服’、‘紅塔山’種子發(fā)芽高峰推遲2 d。Pb2+脅迫時，‘和服’種子發(fā)芽高峰的變化情況與Cu2+脅迫一致；‘紅塔山’種子的發(fā)芽高峰，則在50、200、350 mg/L Pb2+脅迫時發(fā)芽高峰推遲1 d；質(zhì)量濃度500 mg/L的Pb2+脅迫時，‘紅塔山’種子的發(fā)芽高峰保持不變，但隨后幾天的發(fā)芽率波動較大。

圖1 Cu2+脅迫時‘和服’種子的發(fā)芽進程

2.3 Cu2+、Pb2+脅迫時2個鳳尾雞冠花品種種子復(fù)水效果

本試驗中，無論哪種重金屬脅迫溶液質(zhì)量濃度，鳳尾雞冠花種子的發(fā)芽率都超過60%。經(jīng)過未萌發(fā)種子的復(fù)水試驗，低質(zhì)量濃度(50～200 mg/L)Cu2+脅迫后的未發(fā)芽種子有少量萌發(fā)；高質(zhì)量濃度(350～500 mg/L)重金屬脅迫后的未發(fā)芽種子基本沒有新的萌發(fā)，萌發(fā)恢復(fù)率為0(見表5)。Pb2+脅迫后種子的復(fù)水萌發(fā)率，整體趨勢與Cu2+脅迫一致，但整體發(fā)芽率高于Cu2+脅迫的，說明同等質(zhì)量濃度時，Cu2+脅迫對鳳尾雞冠花種子的毒害作用更強，且高質(zhì)量濃度時這種毒害是不可逆的。

圖4 Pb2+脅迫時‘紅塔山’種子的發(fā)芽進程

表5 2個鳳尾雞冠花品種種子復(fù)水萌發(fā)率

2.4 Cu2+、Pb2+脅迫時2個鳳尾雞冠花品種種子胚根長度

經(jīng)過Cu2+脅迫的鳳尾雞冠花種子，在第1天初發(fā)芽時的胚根長度顯著低于對照。在Cu2+處理液質(zhì)量濃度50 mg/L時，種子胚根的長度變化緩慢，極顯著低于對照(見表6)，胚根近50%的長度為黑色；在Cu2+處理液質(zhì)量濃度200 mg/L時，種子胚根的長度變短，未出現(xiàn)子葉，且胚根接近全黑；在Cu2+處理液質(zhì)量濃度350～500 mg/L時，胚根長度更短，種子發(fā)芽后胚根基本未見生長，并且在后期全部發(fā)生色變，接近死亡狀態(tài)。由此可見，重金屬Cu2+對種子胚根的抑制作用十分顯著。

Pb2+處理液質(zhì)量濃度50 mg/L則促進了胚根的生長(見表6)。其中，‘和服’鳳尾雞冠花種子的胚根長度顯著高于對照(P<0.05)。其他質(zhì)量濃度Pb2+脅迫抑制了胚根的生長，胚根長度與對照相比差異顯著(P<0.05)。在Pb2+處理液質(zhì)量濃度50 mg/L時，胚根先端沒有色變，子葉發(fā)育正常；在Pb2+處理液質(zhì)量濃度200 mg/L至更高時，胚根的生長顯著受到抑制，與對照相比急劇變短，并在胚根先端出現(xiàn)色變、有灰色斑點，隨著處理液質(zhì)量濃度增加，斑點顏色加深、面積增大。

表6 重金屬脅迫2種鳳尾雞冠花胚根長度

3 討論

種子萌發(fā)是植物生活史的起點，也是植物感知外界環(huán)境條件最初生命階段，對重金屬污染最為敏感。很多研究表明，重金屬脅迫對植物的種子萌發(fā)及幼苗生長具有不同的影響。肖志華等[10]研究表明，外源Cu2+脅迫對不同基因型谷子幼苗發(fā)育具有低質(zhì)量濃度促進、高質(zhì)量濃度抑制的效應(yīng)；王椏楠等[11]研究表明，在Pb2+脅迫下雞爪大黃種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)均比對照組極顯著下降；齊世靜等[12]在小白菜對Pb2+的響應(yīng)機理研究中發(fā)現(xiàn)，Pb2+處理對小白菜根長和地上部分生長均有一定的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的升高，抑制作用逐漸增強。本研究中，2個鳳尾雞冠花品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)，均隨著Cu2+處理液質(zhì)量濃度的升高而降低；Pb2+處理液質(zhì)量濃度50 mg/L時，鳳尾雞冠花的各項萌發(fā)指標有所升高，高質(zhì)量濃度的Pb2+脅迫會抑制種子的萌發(fā)，說明低質(zhì)量濃度的Pb2+處理促進種子發(fā)芽。低質(zhì)量濃度的Pb2+可以刺激植物自身的抗逆性反應(yīng)，使植物胚乳液化和分解的能力增強，提高胚的生理活性，因此，在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚根生長等暫時升高的現(xiàn)象；而高質(zhì)量濃度的重金屬離子，破壞了植物的自我防御機制，造成植物機體代謝紊亂，生長受阻，甚至死亡。本研究試驗的結(jié)果與陳偉等[13]、張震等[14]的研究結(jié)果基本一致。鳳尾雞冠花在處理液質(zhì)量濃度500 mg/L的Cu2+、Pb2+脅迫時，種子仍分別有60%、70%以上的發(fā)芽率，說明鳳尾雞冠花對Cu2+、Pb2+有一定的耐受性，其中對Pb2+的耐受性高于對Cu2+的耐受性，‘紅塔山’的耐受性略高于‘和服’的耐受性。

從胚根的生長情況看，2種鳳尾雞冠花在各質(zhì)量濃度Cu2+處理時，均表現(xiàn)出對胚根的抑制作用；而在低質(zhì)量濃度Pb2+處理時，表現(xiàn)出對胚根的促進作用，體現(xiàn)了Pb2+對種子萌發(fā)的“低促高抑”作用。質(zhì)量濃度50 mg/L以上的銅、鉛脅迫時，胚根顏色變深、根尖受害顯著，說明質(zhì)量濃度50 mg/L以上的2種重金屬已經(jīng)造成了根尖細胞的異常分裂，胚根生長滯懈；較高質(zhì)量濃度的2種重金屬脅迫，甚至導(dǎo)致鳳尾雞冠花種子發(fā)芽后幾乎不再生長，成壞死狀態(tài)。通常重金屬對植物根的抑制作用大于芽[15-16]，種子萌發(fā)后，根最先突破種皮吸水，從而使根尖的重金屬累積量以及受脅迫時間較重。這與恩慈等[17]、李軍紅等[18]的重金屬脅迫研究結(jié)果相一致。

綜合Cu2+、Pb2+脅迫對‘和服’、‘紅塔山’鳳尾雞冠花種子萌發(fā)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽動態(tài)變化的影響，相對而言，Cu2+對2種鳳尾雞冠花種子萌發(fā)的抑制較強，在Pb2+低質(zhì)量濃度時表現(xiàn)出促進發(fā)芽的作用。較高質(zhì)量濃度的Cu2+、Pb2+脅迫，均使發(fā)芽速度變慢，發(fā)芽不集中，發(fā)芽后的胚根生長速度也比較慢，高質(zhì)量濃度的Cu2+、Pb2+脅迫造成了種子和胚根的傷害，出現(xiàn)胚根停止生長、變黑甚至腐爛的情況。本試驗根據(jù)相關(guān)方程預(yù)測2品種鳳尾雞冠花種子耐受金屬的質(zhì)量濃度范圍，為鳳尾雞冠花進一步的抗重金屬污染研究提供參考。鳳尾雞冠花在質(zhì)量濃度500 mg/L的Cu2+、Pb2+脅迫時，仍有較高的萌發(fā)率，但在萌發(fā)后會出現(xiàn)胚根受金屬脅迫影響嚴重的現(xiàn)象，說明裸露的胚根對這2種重金屬脅迫反映敏感；鳳尾雞冠花種子不同萌發(fā)階段和對應(yīng)器官的重金屬耐受性、耐受機理還有待進一步的研究。