曹 梅 王興強(qiáng) 秦傳新 沈 曄 張子楊 錢詩悅

脊尾白蝦對(duì)低氧響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析*

曹 梅1王興強(qiáng)1①秦傳新2沈 曄1張子楊1錢詩悅1

(1. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院 連云港 222005; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510300)

本研究通過高通量測序，分析低氧脅迫下脊尾白蝦()某些基因的差異表達(dá)，獲得10.62 Gb高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，組裝得到155113條轉(zhuǎn)錄本和118953條Unigene。注釋Unigene 37580條。其中，33659條Unigene與Nr蛋白數(shù)據(jù)庫基因同源；11275條Unigene注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，歸類到223個(gè)代謝通路。低氧脅迫產(chǎn)生1392條差異表達(dá)基因，包括311條上調(diào)基因和1081條下調(diào)基因，784條差異基因得到注釋，并富集到抗氧化活性、細(xì)胞連接、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、多細(xì)胞生物過程、復(fù)制和生殖等過程，表明低氧脅迫激活了蝦體適應(yīng)缺氧的一系列生理活動(dòng)。其中，低氧脅迫下，低氧誘導(dǎo)因子1() 2個(gè)亞基和表達(dá)量上調(diào)；實(shí)時(shí)定量測定證實(shí)，在脅迫的后期，脊尾白蝦肝胰臟和鰓和明顯上調(diào)，推測脊尾白蝦細(xì)胞在低溶氧環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生，刺激機(jī)體增加血液氧的供應(yīng)能力。同時(shí)，低氧脅迫下，脊尾白蝦差異基因富集到糖酵解/葡萄糖生成、精氨酸和脯氨酸代謝和丙酮酸代謝等通路，表明蝦體缺氧使糖酵解等無氧代謝途徑增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)了部分糖類和氨基酸的代謝。另外，低氧脅迫下，脊尾白蝦溶酶體通路、吞噬通路、過氧化物酶體通路和內(nèi)吞作用通路的差異基因較多，推測低氧誘導(dǎo)因子可能通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬來降低線粒體氧耗。

脊尾白蝦；低氧脅迫；轉(zhuǎn)錄組分析；差異基因表達(dá)

溶解氧是對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中重要的環(huán)境因子，直接影響對(duì)蝦的存活、生長、代謝、消化和免疫能力。養(yǎng)殖環(huán)境中溶解氧受諸多因素的影響，環(huán)境中浮游植物優(yōu)勢(shì)種群的突然改變或死亡、陰天暴雨及過量投餌造成的池塘水質(zhì)污染等都會(huì)導(dǎo)致溶解氧急劇下降(鄭慧等, 2014; 李根瑞等, 2016)。此時(shí)，凡納濱對(duì)蝦()、日本沼蝦()、細(xì)角濱對(duì)蝦()和羅氏沼蝦()等抗氧化活性和免疫力發(fā)生顯著變化(Han, 2018)。低氧脅迫時(shí)，日本沼蝦有氧代謝減弱，無氧酵解和抗氧化能力增強(qiáng)，糖原和磷酸精氨酸大量消耗，以維持機(jī)體能量需要(Sun, 2018)。其中，低氧誘導(dǎo)因子1 ()是蝦體維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由受氧調(diào)節(jié)的α亞基和組成型表達(dá)的β亞基組成，最先由Semenza(1992)在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)，參與許多重要的生物學(xué)反應(yīng)。例如，和亞基均參與蝦類缺氧適應(yīng)性反應(yīng)(Terova, 2010; 連春盎, 2016)。缺氧時(shí)，凡納濱對(duì)蝦鰓、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和肝胰臟磷酸果糖激酶、果糖-1,6-二磷酸酶表達(dá)量顯著增高，而或亞基的沉默阻斷了鰓中己糖激酶表達(dá)和酶活性誘導(dǎo)(Camacho-Jiménez, 2018)。通常情況下，的穩(wěn)定性和活性由決定，的調(diào)節(jié)受多種因素影響，且為專一受O2調(diào)控的亞基。的N末端用來介導(dǎo)α和β兩亞基二聚化及與靶基因特異DNA序列結(jié)合，的C末端用來介導(dǎo)降解和反式激活，含有2個(gè)獨(dú)立的反式激活結(jié)構(gòu)域，2個(gè)結(jié)構(gòu)域序列間為負(fù)調(diào)控反式激活結(jié)構(gòu)域，而中部是氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(Oxygen dependent degradation domain, ODDD)，ODDD決定的穩(wěn)定性。在常氧條件下，位于ODDD內(nèi)的脯氨酸殘基的羥基化可促進(jìn)HIF1α的泛素化和蛋白酶的降解，這種羥基化作用由多聚羥化酶介導(dǎo)。其中，脯氨酸羥化酶(PHDs)被認(rèn)為在細(xì)胞質(zhì)中廣泛表達(dá)，且在羥基化中作用最大。另一種羥基化酶是抑制劑，主要進(jìn)行天門冬氨酰殘基的羥基化，進(jìn)而抑制的激活(李國青等, 2005)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可用于分析不同組織或生理狀態(tài)下某些基因表達(dá)水平的差異，發(fā)掘與特定生理功能相關(guān)的未知基因。本研究通過高通量測序，分析低氧脅迫下脊尾白蝦()某些基因的差異表達(dá)，可為進(jìn)一步揭示蝦體響應(yīng)低氧脅迫的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 低氧脅迫實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，脊尾白蝦暫養(yǎng)1周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。暫養(yǎng)期間，海水溫度為22℃~ 24℃、鹽度為29、pH為8.1，人工增氧。隨機(jī)挑選濕重為(3.15±0.26) g的脊尾白蝦60只，分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)水族箱(水體約50 L)放養(yǎng)10只脊尾白蝦，人工增氧適應(yīng)24 h，哈希(HACH) DR900測定實(shí)驗(yàn)水體溶解氧濃度為7.6 mg/L。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，停止低氧脅迫組的人工增氧，水族箱用2 mm厚液體石蠟封閉。脅迫約3.5 h后，脊尾白蝦蝦體從尾部開始變白；約4 h后，開始側(cè)臥游動(dòng)，猜測其處于昏厥狀態(tài)，此時(shí)，水體溶解氧濃度為(1.13±0.26) mg/L，脊尾白蝦整體取樣，速凍于液氮中備用。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，低氧脅迫條件下，白蝦側(cè)臥后約10~20 min死亡。為確保取到新鮮的樣品，白蝦側(cè)臥游動(dòng)時(shí)馬上取樣。對(duì)照組保持人工增氧，白蝦游動(dòng)正常，溶解氧濃度為(7.59±0.66) mg/L，同樣取樣凍存。

1.1.2 基因表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前，脊尾白蝦暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)條件同1.1.1。隨機(jī)挑選濕重為(2.77±0.34) g的脊尾白蝦120只，分為2組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)水族箱(水體約為100 L)放養(yǎng)20只白蝦，人工增氧適應(yīng)24 h，哈希(HACH) DR900測得水體溶解氧濃度為7.6 mg/L。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，低氧脅迫組停止人工增氧，水族箱用2 mm厚液體石蠟封閉，在0、10、20、40、120、240和480 min，從每個(gè)箱中取2只蝦，解剖取出肌肉、鰓和肝胰臟，液氮速凍，取樣時(shí)間點(diǎn)水體溶解氧濃度分別為(8.05±0.40)、(7.21±0.23)、(6.71± 0.18)、(6.10±0.22)、(5.81±0.25)、(4.08±0.47)和(2.03± 0.15) mg/L；對(duì)照組保持人工增氧，白蝦游動(dòng)正常，溶解氧濃度為(8.11±0.42) mg/L，同樣取樣凍存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將1.1.1中凍存的低氧脅迫組和對(duì)照組樣品分別在液氮中全蝦研磨混合，常規(guī)方法提取總RNA。采用帶有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入破碎液，將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷，以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)合成雙鏈cDNA鏈。利用AMPure XP beads純化cDNA，對(duì)純化的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加尾并連接測序接頭，然后，采用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后，通過PCR富集得到cDNA文庫。送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行HiSeq2500高通量測序，測序讀長為PE125。

1.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除其中的接頭及低質(zhì)量Reads，獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。將高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)通過Trinity軟件進(jìn)行序列組裝，獲得該物種的Unigene庫。將低氧脅迫組和對(duì)照組高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)與組裝得到的Unigene庫進(jìn)行序列比對(duì)和基因表達(dá)量分析，篩選差異表達(dá)的基因。使用BLAST軟件將Unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得Unigene及差異表達(dá)基因的功能注釋信息。使用TransDecoder軟件進(jìn)行Unigene基因結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.4 實(shí)時(shí)定量測定

常規(guī)方法提取1.1.2中的樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。同時(shí)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，引物序列見表1；利用軟件SPSS 11進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以<0.05作為差異顯著水平。

表1 脊尾白蝦實(shí)時(shí)定量所用引物序列

Tab.1 Sequences of P. carincauda qRT-PCR primers

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝

完成對(duì)照和低氧脅迫組脊尾白蝦樣品的轉(zhuǎn)錄組測序，獲得10.62 Gb高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，各樣品高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)均達(dá)到5.27 Gb，質(zhì)量值≥30的堿基所占的百分比(Q30)≥90.21%(表2)。

應(yīng)用Trinity對(duì)高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到155113條轉(zhuǎn)錄本和118953條Unigene，轉(zhuǎn)錄本與Unigene的N50分別為1940和928 (表2)。序列長度為200~300 nt的Unigene最多，占總數(shù)的42.76%；300~500 nt的有33316條，占28.01%；500~1000 nt有19088條，占16.05%；1000~2000 nt有9112條，占7.66%；2000 nt以上的Unigene有6569條，占5.52%。

表2 高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)

Tab.2 Statistics for evaluation of clean sequencing data

注：Q30：質(zhì)量值≥30的堿基所占的百分比

Note: Q30: Percentage of bases quality score which is greater than or equal to 30

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Tab.3 Statistics of assembly results

2.2 Unigene功能注釋

對(duì)脊尾白蝦Unigene進(jìn)行功能注釋，選擇BLAST參數(shù)≤10–5和HMMER參數(shù)≤10–10，獲得37580條有注釋信息的Unigene (表3)。其中，COG得到注釋的Unigene 12527條，GO 13878條，KEGG 11275條。

與Nr蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，有33659條白蝦Unigene與已知基因同源，在Nr蛋白數(shù)據(jù)庫中，與蝦類相關(guān)的注釋信息較少(圖1)。相似序列比例最高為內(nèi)華達(dá)古白蟻() (2787條，8%)，隨后依次是蚤狀蚤(, 1765)、隆頭蛛(, 1169)、文昌魚(, 1046)、囊舌蟲(, 1019)、紫海膽(, 965)、赤擬谷盜(, 871)、卡氏棘阿米巴(, 735)、海蠕蟲(, 644)、霸王蓮花青螺(, 605)、凡納濱對(duì)蝦(217)、羅氏沼蝦(107)、中國對(duì)蝦(, 92)和日本沼蝦(, 79)。

表4 Unigene注釋統(tǒng)計(jì)

Tab.4 Statistics of Unigene annotated

圖1 Nr同源物種分布

11275條脊尾白蝦Unigene注釋到KEGG，歸類為223個(gè)代謝通路，其中，基因數(shù)量排名前20的通路如圖2所示，包括核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、剪接體、溶酶體、氧化磷酸化、糖酵解/糖異生、吞噬體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、嘌呤代謝、mRNA監(jiān)測、內(nèi)吞、信號(hào)通路、蛋白酶體、過氧化物酶體、真核生物核糖體生物合成、丙酮酸代謝、嘧啶代謝、檸檬酸循環(huán)和RNA降解。另外，在代謝通路中與低氧有關(guān)的還包括信號(hào)通路、信號(hào)通路、自噬調(diào)節(jié)、信號(hào)通路、癌癥通路、信號(hào)通路和精氨酸與脯氨酸代謝。

圖2 Unigene的KEGG分析

顯示基因數(shù)量排名前20位的KEGG通路

Top 20 of gene number in KEGG pathway

2.3 差異表達(dá)基因分析

低溶氧脅迫脊尾白蝦產(chǎn)生1392條差異表達(dá)基因，包括311條上調(diào)基因和1081條下調(diào)基因。對(duì)脊尾白蝦差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，共注釋到784條差異基因，其中，COG 232條，GO 240條，KEGG 206條，KOG 460條，Pfam 587條，Swiss-Prot 542條，Nr 742條。圖3展示了白蝦差異表達(dá)基因和所有基因在GO各二級(jí)功能中的注釋情況，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集到抗氧化活性、細(xì)胞連接、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、多細(xì)胞生物過程、復(fù)制和生殖等過程。

利用COG對(duì)脊尾白蝦差異表達(dá)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類，發(fā)現(xiàn)碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和修復(fù)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和分子伴侶等4類富集的差異基因超過20個(gè)。其次，無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂和染色體分離、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成、次生代謝產(chǎn)物生物合成、運(yùn)輸和代謝等過程富集的差異基因較多(圖4)。

按照KEGG通路類型分類，脊尾白蝦差異表達(dá)基因分別注釋到環(huán)境信息處理、人類疾病、遺傳信息處理、代謝、細(xì)胞過程和有機(jī)系統(tǒng)6個(gè)分支。其中，遺傳信息處理、代謝和細(xì)胞過程這3大類通路中脊尾白蝦差異基因富集較多。在這些代謝通路中，泛素介導(dǎo)的蛋白水解和溶酶體富集的差異基因最多，分別為11和10條；其次是吞噬(4)、過氧化物酶體(4)和內(nèi)吞作用(3)；另外，還包括糖酵解/葡萄糖生成(6)、精氨酸和脯氨酸代謝(4)、果糖和甘露糖代謝(4)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(4)和丙酮酸代謝(2)(圖5)。

表5為篩選出的部分脊尾白蝦差異表達(dá)基因，KOG分類注釋包括3條氨基酸的運(yùn)輸和代謝基因(Amino acid transport and metabolism)、5條碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝基因(Carbohydrate transport and metabolism)、2條防御機(jī)制基因(Defense mechanisms)、2條能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化基因(Energy production and conversion)、7條一般功能預(yù)測基因(General function prediction only)、6條無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因(Inorganic ion transport and metabolism)、3條脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝基因(Lipid transport and metabolism)、9條翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和蛋白質(zhì)伴侶基因(Posttranslational modification, protein turnover, chaperones)、1條復(fù)制、重組和修復(fù)基因(Replication, recombination and repair)、2條次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝基因(Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)、7條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制基因(Signal transduction mechanisms)、1條轉(zhuǎn)錄基因(Transcription)和1條翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源基因(Translation, ribosomal structure and biogenesis)。log2FC數(shù)值最大的為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)，為4.98；其次是DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白(DNA mismatch repair protein)，為3.38。log2FC數(shù)值最小的為組織蛋白酶l (Cathepsin l)，為–6.89；其次是內(nèi)切幾丁質(zhì)酶(Endochitinase)，–6.58。

圖3 差異表達(dá)基因GO二級(jí)節(jié)點(diǎn)注釋統(tǒng)計(jì)

橫坐標(biāo)為GO三大分類下的二級(jí)節(jié)點(diǎn)，縱坐標(biāo)表示注釋到該節(jié)點(diǎn)的基因數(shù)目及占所有基因數(shù)目的百分比，紅色柱體表示所有基因的注釋情況，藍(lán)色柱體表示差異表達(dá)基因的注釋情況

The abscissa is the secondary node under the three categories of GO. The ordinates represent the number of genes annotated to the node and the percentage of all genes. The red column represents the annotation of all genes, and the blue column represents the annotation of differentially expressed genes

圖4 差異表達(dá)基因COG注釋分類

橫坐標(biāo)為COG各分類內(nèi)容，縱坐標(biāo)為基因數(shù)目

The abscissa is the classification content of COG, and the ordinate is the number of genes

圖5 差異表達(dá)基因KEGG分類

縱坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標(biāo)為注釋到該通路下的基因個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的基因總數(shù)的比例

The ordinate is the name of KEGG metabolic pathway. The abscissa is the number of genes annotated to the pathway and the proportion of the number of genes annotated to the total number of genes annotated

2.4 低氧脅迫對(duì)HIF1信號(hào)通路基因表達(dá)的影響

本研究中，密切相關(guān)的差異基因有4個(gè)，和缺氧時(shí)表達(dá)量上調(diào)，而抑制劑()和表達(dá)量下調(diào)。從轉(zhuǎn)錄組測序注釋到的缺氧信號(hào)通路看出，的表達(dá)受、和等信號(hào)通路關(guān)鍵因子的影響(圖6)。

表5 部分差異表達(dá)基因

Tab.5 Part of differentially expressed gene

續(xù)表5

注：FPKM：基因表達(dá)量；log2FC：基因表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值

Note: FPKM: Gene expression level; log2FC: Logarithm of differential multiple of gene expression level

由圖7可以看出，在0~120 min內(nèi)，隨著低氧脅迫時(shí)間的延長，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓基因表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)；而在240 min，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓基因表達(dá)與對(duì)照組相比，明顯上調(diào)；其中，低氧脅迫對(duì)脊尾白蝦肝胰臟基因表達(dá)影響顯著(<0.05)。在10~20 min時(shí)間范圍內(nèi)，隨著低氧脅迫時(shí)間的延長，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓基因表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)；其中，低氧脅迫對(duì)脊尾白蝦鰓基因表達(dá)影響顯著(<0.05)。在0~20 min時(shí)間范圍內(nèi)，隨著低氧脅迫時(shí)間的延長，脊尾白蝦肝胰臟、肌肉和鰓和基因表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)；其中，低氧脅迫對(duì)脊尾白蝦所有組織和基因表達(dá)影響顯著(<0.05)。

3 討論

曾地剛等(2013)通過454技術(shù)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟轉(zhuǎn)錄組測序，獲得20225條Unigene。閆允君等(2020)利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)中國對(duì)蝦對(duì)照組和肌肉生長抑制素()表達(dá)抑制組進(jìn)行了測序分析，發(fā)現(xiàn)Mstn表達(dá)被抑制后共篩選到1657個(gè)差異表達(dá)基因，其中，805個(gè)顯著上調(diào)，852個(gè)顯著下調(diào)，初步篩選出29個(gè)調(diào)控的與肌肉生長相關(guān)的基因，為闡明對(duì)蝦的肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。劉欣(2016)獲得日本沼蝦Unigenes 142560條，其中，43038條獲得注釋，占總Unigene的30.20%。本研究組裝得到155113條轉(zhuǎn)錄本和118953條Unigene，獲得37580條有注釋信息的Unigene，占31.59%，其中，COG注釋Unigene 12527條，GO 13878條，KEGG 11275條，Nr 33659條；在223個(gè)KEGG代謝通路中，信號(hào)通路、信號(hào)通路、信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、癌癥通路、自噬調(diào)節(jié)、精氨酸與脯氨酸代謝等通路與低氧脅迫有關(guān)。未獲得功能注釋的Unigene 81373條，占68.41%(表2、表3)。未注釋的原因可能與組裝的序列太短有關(guān)，轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene長度在500 nt以下的占總量的70.77%，增加了功能注釋的難度。另外，各類數(shù)據(jù)庫功能注釋信息不夠全面，使一些基因不能夠得到相應(yīng)的注釋，例如，在Nr注釋中，白蝦Unigene僅與217條凡納濱對(duì)蝦、107條羅氏沼蝦、92條中國對(duì)蝦和79條日本沼蝦基因同源。

圖6 缺氧HIF1信號(hào)通路

紅色為轉(zhuǎn)錄組測序注釋到的Unigene

Red is the Unigene annotated by transcriptome sequencing

圖7 低氧脅迫對(duì)脊尾白蝦基因表達(dá)的影響

同一線條中具有不同字母的數(shù)據(jù)間差異顯著(<0.05)

Data with different letters in the same line is significantly different (<0.05)

機(jī)體為適應(yīng)缺氧環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)一些與紅細(xì)胞生成/鐵代謝、血管生成、葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖/生存和凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)(Terova, 2010)。本研究中，低氧脅迫產(chǎn)生1392條差異表達(dá)基因，784條差異基因得到注釋(表5)。GO和COG注釋表明，抗氧化活性、細(xì)胞連接、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、多細(xì)胞生物過程、復(fù)制和生殖等過程富集的差異基因較多。與GO和COG注釋類似，富集差異基因較多的與免疫有關(guān)的KEGG通路包括泛素介導(dǎo)的蛋白水解，含11條差異表達(dá)基因，其次是溶酶體10條、吞噬4條、過氧化物酶體4條和內(nèi)吞作用3條；而富集差異基因較多的與代謝有關(guān)的KEGG通路包括糖酵解/葡萄糖生成，含6條差異表達(dá)基因，其次是精氨酸和脯氨酸代謝4條、果糖和甘露糖代謝4條、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝4條和丙酮酸代謝2條(圖5)。這些富集的差異基因表明，低氧脅迫激活了蝦體適應(yīng)缺氧的一系列生理活動(dòng)，如誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯，參與應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)白蝦各類物質(zhì)代謝。由表5可以看出，低氧脅迫條件下脊尾白蝦酚氧化酶原激活酶、過氧化物酶l、DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶和G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子等基因顯著上調(diào)。低氧脅迫對(duì)碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝基、防御機(jī)制、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化、一般功能預(yù)測、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝、次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源等過程產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為富集大量下調(diào)的差異表達(dá)基因。

轉(zhuǎn)錄因子是氧傳感的核心成分，還可作為許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這些基因在生理學(xué)和醫(yī)學(xué)中至關(guān)重要(McNamee, 2016; Semenza, 2012)。HIF1α抑制劑PHDs需要氧作為羥化作用的輔助因子，在正常條件下，PHDs通過PHD-HIF途徑羥基化HIF1α保守的脯氨酰殘基，從而靶向被泛素蛋白酶體降解失活。然而，在缺氧或炎癥條件下，PHD-HIF途徑失活，產(chǎn)生穩(wěn)定的、和組成轉(zhuǎn)錄活性二聚體移位至細(xì)胞核，與缺氧調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)，這些區(qū)域通常是啟動(dòng)子內(nèi)的“缺氧反應(yīng)元件”；一方面，通過激活促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因表達(dá)促進(jìn)紅細(xì)胞生成，激活血清鐵傳遞蛋白(TF)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFRC)基因表達(dá)促進(jìn)鐵代謝，激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體(Flt1)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、血管生成素(ANGPT)和金屬肽酶抑制劑(TIMP1)等基因表達(dá)促進(jìn)血管生成，激活血紅素加氧酶1(HMOX1)增強(qiáng)血管張力，通過以上調(diào)控增強(qiáng)氧的傳遞；另一方面，通過激活磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1(PDK1)抑制三羧酸循環(huán)代謝，激活磷酸甘油脫氫酶(GPDH)、己糖激酶(HK)、α烯醇化酶(ENO 1)、6-磷酸果糖激酶2(PFK 2)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)等表達(dá)促進(jìn)厭氧代謝，激活B淋巴細(xì)胞瘤2()和蛋白調(diào)節(jié)增殖凋亡、降低O2消耗，通過以上調(diào)控，緩解機(jī)體對(duì)缺氧的不適(圖6)。當(dāng)處于缺氧條件下，草魚()、石首魚()、黑鱸()和河鱸()一些組織中HIF1α轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(Terova, 2010)。任倩妍等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，大彈涂魚()在缺氧環(huán)境下HIF信號(hào)通路被激活，肝中低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)量上調(diào)。Okamura等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，日本沼蝦表達(dá)水平在缺氧刺激24 h后顯著增加，缺氧刺激6 h后腫瘤抑制劑基因表達(dá)顯著下降。與以上研究類似，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，和缺氧時(shí)表達(dá)量上調(diào)；低氧脅迫實(shí)時(shí)定量測定證實(shí)，在脅迫的后期，脊尾白蝦肝胰臟和鰓和明顯上調(diào)，表明脊尾白蝦細(xì)胞在低溶氧環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生，刺激機(jī)體增加血液氧的供應(yīng)能力。還激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖酵解酶、血管內(nèi)皮生長因子等，通過提高糖轉(zhuǎn)運(yùn)和促進(jìn)糖酵解以適應(yīng)缺氧環(huán)境(Zhou, 2018)。周曉黎等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，阻斷信號(hào)途徑，結(jié)腸癌細(xì)胞中下調(diào)，并可導(dǎo)致糖酵解相關(guān)蛋白如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1和乳酸脫氫酶A的表達(dá)下降，糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸含量下降。本研究中，糖酵解/葡萄糖生成通路、精氨酸和脯氨酸代謝和丙酮酸代謝富集大量差異表達(dá)基因(圖5)，也說明機(jī)體缺氧使糖酵解等無氧代謝途徑增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)了部分糖類和氨基酸的代謝。

細(xì)胞自噬通過分解代謝和再循環(huán)來消除受損或有害成分，以維持營養(yǎng)和能量穩(wěn)態(tài)，涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器或胞質(zhì)組分的溶酶體降解；該途徑可通過多種形式的細(xì)胞應(yīng)激來刺激，包括營養(yǎng)或生長因子剝奪、缺氧、活性氧物質(zhì)、DNA損傷、蛋白質(zhì)聚集體、受損細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)病原體(Kroemer, 2010; 馬驪等, 2018)。在自噬過程中，細(xì)胞形成雙膜囊泡、自噬體、隔離細(xì)胞器，蛋白質(zhì)或部分細(xì)胞等遞送至溶酶體細(xì)胞質(zhì)，溶解體中的隔離內(nèi)容物被降解(He, 2009)。自噬構(gòu)成了一種主要的保護(hù)機(jī)制，使細(xì)胞能夠在多種應(yīng)激源的作用下存活，并有助于保護(hù)生物免受退化、炎癥、感染和腫瘤疾病的侵害(Levine, 2008; Mizushima, 2008)。在Snare蛋白及小Rab GTP激酶的作用下，自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，發(fā)揮其降解功能(徐倩等, 2017)。缺氧可通過途徑誘導(dǎo)自噬激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移，以誘導(dǎo)肺血管重塑(Jing, 2018)。閆廣偉等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境可能通過途徑誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)。本研究代謝通路中，溶酶體通路、吞噬通路、過氧化物酶體通路和內(nèi)吞作用通路富集的差異基因較多(圖5)，這些差異基因的表達(dá)也證實(shí)可能與缺氧引起的自噬有關(guān)。推測可通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬來降低線粒體氧耗。

綜上所述，低氧脅迫可誘導(dǎo)脊尾白蝦產(chǎn)生低氧誘導(dǎo)因子調(diào)控下游基因表達(dá)，進(jìn)而激活蝦體適應(yīng)缺氧的一系列生理活動(dòng)，增強(qiáng)脊尾白蝦各類物質(zhì)代謝，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管張力，刺激蝦體增加血液氧供應(yīng)能力；另一方面，低氧脅迫促進(jìn)厭氧代謝，緩解蝦體對(duì)缺氧的不適，而低氧誘導(dǎo)因子可通過抑制線粒體生物合成和活化線粒體自噬來降低線粒體氧耗。

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Transcriptome Analysis ofSubjected to Hypoxic Stress

CAO Mei1, WANG Xingqiang1①, QIN Chuanxin2, SHEN Ye1, ZHANG Ziyang1, QIAN Shiyue1

(1. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment; South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Sciences, Guangzhou 510300)

A rapid reduction in the dissolved oxygen concentration of water is an important factor contributing to disease in shrimps. In this study, we examined differential gene expression in the shrimpunder conditions of hypoxic stress. We obtained 10.62 Gb of high-quality sequencing data, from which 155113 transcripts and 118953 unigenes were assembled. Among the unigenes, 37580 were annotated and 33659 were found to be homologous to genes in the Nr protein database. We also annotated 11275 unigenes using the KEGG database, which were further classified into 223 metabolic pathways. We detected 1392 genes that were differentially expressed in shrimps exposed to hypoxic stress, among which 311 and 1081 were up- and down-regulated, respectively, and 784 were annotated. The enrichment of differentially expressed genes in antioxidant activity, cell connection, protein-binding transcription factor activity, multicellular biological processes, replication, and reproductive processes indicated that exposure to hypoxia activated a series of physiological responses in shrimps associated with adaptation to low levels of dissolved oxygen. Among the genes up-regulated under hypoxic stress was hypoxic induction factor 1 (), which is comprised the two subunitsand. RT-PCR analysis revealed that during the latter stages of hypoxic stress, there was a notable up-regulated expression ofandin the hepatopancreas and gills of. These observations indicated thatcells induced hypoxic induction factor production in a hypoxic environment, thereby inducing an increase in blood oxygen supply. We also detected an enrichment of differentially expressed genes in the glycolysis/glucose generation pathway, arginine and proline metabolism, and pyruvate metabolism in response to hypoxic stress, which indicated an upregulation of anaerobic metabolic processes such as glycolysis, and increased metabolism of certain carbohydrates and amino acids. In addition, we detected numerous differentially expressed genes associated with the pathways involving lysozymes, phagocytosis, peroxisomes, and endocytosis inexposed to hypoxia, thereby indicating that HIFs might reduce mitochondrial oxygen consumption by inhibiting mitochondrial biosynthesis and activating mitochondrial autophagy.

; Stress hypoxic; Transcriptome analysis; Differential gene expression

WANG Xingqiang, E-mail: hyxywxq@qq.com

S917.4; S968.22

A

2095-9869(2021)02-0112-12

10.19663/j.issn2095-9869.20190924001

http://www.yykxjz.cn/

曹梅, 王興強(qiáng), 秦傳新, 沈曄, 張子楊, 錢詩悅. 脊尾白蝦對(duì)低氧響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(2): 112–123

Cao M, Wang XQ, Qin CX, Shen Y, Zhang ZY, Qian SY. Transcriptome analysis ofsubject to hypoxic stress. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(2): 112–123

* 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(HS16005)、廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(FEEL-2019-3)、江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目(SZ201811641105001; SY201811641105001)和連云港市“海燕計(jì)劃”科研項(xiàng)目共同資助 [This work was supported by Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology Open Fund (HS16005), Fund of Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment (FEEL-2019-3), Practical Innovation Project for College Students in Jiangsu (SZ201811641105001; SY201811641105001), and Lianyungang “Petrel Project” Scientific Research Project]. 曹 梅，E-mail: 593627216@qq.com

王興強(qiáng)，教授，E-mail: wangxingqiang@jou.edu.cn

2019-09-24,

2020-02-14

(編輯 馮小花)