弘子姍，譚超，楊寧

(云南農業(yè)大學 食品科學技術學院，云南 昆明，650201)

麝香貓(Viverrazibetha)分布于中國、印尼、孟加拉等國的熱帶雨林、亞熱帶常綠闊葉林[1-4]，是我國二級重點保護動物，并入選瀕危野生動植物種國際貿易公約[5]。成熟咖啡果被麝香貓取食后在胃蛋白酶等的作用下咖啡果皮、果膠質水解，一般固體食物在pH 1.3～1.8的胃部消化3～4 h，隨后進入小腸，pH值升至3.5，在胰蛋白酶作用下停留約0.5～1 h，最終到達大腸形成殘渣排出，整個過程8～10 h，這樣的咖啡便被稱作“麝香貓咖啡”或“貓屎咖啡”(Kopi Luwak)。由于其數(shù)量稀少，產量極低，風味獨特價格不菲。近年來針對貓屎咖啡也有一些研究，MARCONE[6]在麝香貓消化道中發(fā)現(xiàn)的酶解過程改變了咖啡豆的化學成分，并能改變咖啡烘焙后的感官品質。MARTINEZ[7]等采用豬胃蛋白酶處理咖啡以改善咖啡的口感，減少咖啡苦味，改善香氣和咖啡杯品。佟世生等[8]以云南小?？Х热テr果利用胃蛋白酶處理后的咖啡感官評價結果高于未處理組。云南是優(yōu)質咖啡生長的沃土，貢獻著約95%的中國和1%的世界咖啡產量，但多以初級產品出口，技術含量低，高品質技術的咖啡研究相對欠缺。目前國內外已有一些采用咖啡鮮果酶解[9]和發(fā)酵[10-11]方式進行體外模擬麝香貓咖啡的研究，但由于咖啡鮮果加工有季節(jié)性因素影響，利用干豆復水酶解體外模擬發(fā)酵咖啡尚未見報道。此外常規(guī)咖啡生產中發(fā)酵均為自然露天發(fā)酵，給咖啡品質帶來了不確定性。本研究以云南阿拉比卡咖啡干豆為原料，經復水利用胃、胰蛋白酶進行體外模擬發(fā)酵，結合杯測、理化、風味特征分析，對發(fā)酵咖啡品質進行評價，同時對烘焙咖啡理化、風味特征成分與杯測指標間的相關性進行分析。以期為后期益生菌發(fā)酵咖啡的創(chuàng)新加工，清潔化、批量化生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南阿拉比卡種卡蒂姆咖啡(手工精選S17，全水洗處理，2015年保山豆，海拔約1 000 m，年平均氣溫在18.4～20.0 ℃，年日照2 281～2 453 h，年降雨量1 400～1 700 mm)。120 U/g胃蛋白酶、4 000 U/g胰蛋白酶、牛血清蛋白均為AR級。

1.2 儀器與設備

Brewista 200 mL杯測碗、杯測勺，蘇州順和豐家電科技有限公司；標準生豆、咖啡粉分級篩，臺灣琥珀色咖啡研究室；SANTOKER R500F咖啡烘焙機，北京三豆客科技有限公司；HYP-308型消化爐，上海纖檢儀器有限公司；KDN-04B型凱氏定氮儀，浙江托普儀器有限公司；F800纖維測定儀，濟南海能儀器股份有限公司；METTLER TOLEDO HS153水分測定儀，梅特勒-托利多集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同復水時間對咖啡豆的影響

咖啡生干豆用無菌超純水浸泡0～18 h。測定吸水率(泡后撈起咖啡吸干水質量/干豆質量)，千分尺測量單顆粒豆體體積(長×寬×高)，折光儀測定水中可溶性固形物含量(total soluble solids，TSS)，pH計測定水pH值。

1.3.2 體外發(fā)酵流程

體外模擬發(fā)酵液的制備參考《中國藥典》[12]配制人工胃液(simulated gastric fluid，SGF)、人工小腸液(simulated intestinal fluid，SIF)、人工結腸液(simulated colon fluid，SCF)，流程如下：

復水10 h的咖啡豆→SGF發(fā)酵→SIF發(fā)酵→SCF發(fā)酵→冷凍干燥

將SGF、SIF、SCF分別置于3個自封袋，咖啡豆與發(fā)酵液各按料液比4∶1(g∶mL)混合排空，置于37 ℃恒溫水浴鍋中，依次按SGF、SIF、SCF順序發(fā)酵。發(fā)酵總時間為0、2、4、6、8、10 h，總時間中SGF時間∶SIF時間∶SCF時間=4∶1∶0，發(fā)酵完畢蒸餾水沖洗1次，冷凍干燥。

1.3.3 咖啡豆的烘焙與杯測

用SANTOKER R500E烘焙機烘焙咖啡豆。氣源液化石油氣，火力0.5 kPa，風門4，轉速60 r/min，入豆溫度180～190 ℃，烘焙時間15 min，中深度烘焙(Agtron值控制在60～75，失水率控制在12%～15%)。

采用美國精品咖啡協(xié)會評分標準，參考LINGLE[13]的杯測方法，13人參加杯測，杯測指標中一致性、干凈度、甜度等級均按每項滿分10分給分，平衡性按7.5分給分，不做評測。其他每個小項滿分為10分，以6分為起評分，共分為4個級別， 6分為“好”；7分為“非常好”；8分為“優(yōu)秀”；9分以上為“超凡”。

1.3.4 咖啡基本理化成分分析及數(shù)據(jù)整理

總灰分測定[14]；總膳食纖維測定[15]；還原糖測定y=1.945x-0.040 2(R2=0.993 5)[16]；脂肪測定[17]；總蛋白質測定[18]；多糖測定(蒽酮硫酸比色法)y=18.839x+0.026 1(R2=0.982 5)[19-20]；可溶性蛋白質測定(考馬斯亮藍G250)y=0.008x+0.035 7(R2=0.993 8)[21]；多酚含量測定(福林酚法)y=1.038 6x+0.033 5(R2=0.984 8)[22-23]均參照文獻進行。

游離氨基酸測定：采用酸水解法，色譜條件為Agilent Hypersil ODS柱 (5 μm, 4.0 mm×250 mm)；流動相A:V(27.6 mmol/L醋酸鈉)∶V(三乙胺)∶V(四氫呋喃)=500∶0.11∶2.5， 流動相B:V(80.9 mmol/L醋酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2；流速為1 mL/min;柱溫40 ℃;紫外檢測器檢測波長為338 nm, 以外標法進行定量。

有機酸含量測定：采用離子色譜法，色譜條件為Kromasil C18柱，柱溫40 ℃，流動相為V(乙腈)∶V(25 mmol/L磷酸溶液)=17∶83，流速為1.0 mL/min檢測波長306 nm。

實驗數(shù)據(jù)用Excel整理，采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同浸泡時間對咖啡豆性狀的影響

如圖1所示，咖啡生干豆復水10 h后吸水率、單顆粒體積增長，吸脹作用達到極限；同時水中TSS在12 h后保持相對穩(wěn)定。經18 h吸脹作用，水pH值逐漸從7.02下降至6.26，咖啡生干豆經10～12 h浸泡能充分吸脹，且豆內容物滲出較少。

圖1 浸泡時間對咖啡豆性狀的影響Fig.1 Effect of soaking time on the traits of the coffee beans注：不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 不同發(fā)酵時間對咖啡豆理化成分的影響

如表1所示，在發(fā)酵過程中，多糖呈現(xiàn)下降趨勢,至8 h含量達到最低(3.22±0.28)%(質量分數(shù))，這與胡婕倫[24]的研究結果一致，多糖在強酸性環(huán)境會發(fā)生解聚和斷裂[25]，因此在消化過程中多糖含量逐漸減少，而還原糖含量逐漸上升,至8 h達到最高，為(3.98±0.21)%(質量分數(shù))，這一趨勢與多糖含量的變化相對應，原因可能是多糖分子糖苷鍵發(fā)生斷裂，還原末端增加[26-27]；同時多糖被胃液和小腸液中的胃蛋白酶和胰蛋白酶降解為低聚糖，進而被降解為單糖[28]，因此還原糖含量升高?？偟鞍缀吭谙^程中先下降而后上升再下降，在6 h含量最高為(8.54±0.17)%(質量分數(shù))；可溶性蛋白、酚類消化2 h后呈下降趨勢，這與李俶等[29]的研究結果一致，多酚類物質經過體外模擬胃腸道消化后，多酚含量降低，可能是腸道中的胰蛋白酶對酚類物質進行消化分解的原因[30]；徐俊杰[31]研究表明脂肪的消化是在胃脂酶和胰脂酶的催化作用下發(fā)生水解，本研究結果顯示，脂肪含量在消化2 h后變化不顯著(P>0.05)，膳食纖維和灰分含量變化不顯著(P>0.05)。

表1 發(fā)酵時間對咖啡豆理化性質的影響 單位：%(質量分數(shù))Table 1 Effect of fermentation time on physicochemical properties of coffee beans

2.3 不同發(fā)酵時間對咖啡豆氨基酸含量的影響

如圖2所示，不同發(fā)酵階段咖啡豆中共檢出17種游離氨基酸，其中谷氨酸含量在不同發(fā)酵階段均為最高，平均占總游離氨基酸含量的20.76%。其次為天門冬氨酸、賴氨酸和亮氨酸，平均分別各占總游離氨基酸含量的9.56%、7.87%和7.82%，蛋氨酸平均占總游離氨基酸含量的0.97%，是不同發(fā)酵階段咖啡豆中含量最少的氨基酸。LEE等[32]發(fā)現(xiàn)在咖啡自然發(fā)酵過程中脯氨酸和天冬氨酸濃度會增加1.5倍，但本實驗酶解階段不同游離氨基酸隨發(fā)酵時間的增加變化無規(guī)律。

圖2 發(fā)酵時間對咖啡豆氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the content of amino acids

2.4 不同發(fā)酵時間對咖啡豆呈酸苦味前體物的影響

咖啡的酸味主要來源于咖啡中檸檬酸和蘋果酸[33]，苦味的前體是咖啡中的綠原酸和咖啡因[34]，澀味主要來源于綠原酸、葫蘆巴堿和奎寧酸[35]?？Х冉莺蠛J巴堿和奎寧酸含量下降約50%，這與PANJI等[36]研究結果一致，咖啡消化發(fā)酵后可減少澀味，提高杯品。隨著發(fā)酵時間增加，綠原酸和檸檬酸的含量逐漸增加，可能使產品烘焙后酸苦味增加，蘋果酸含量減少，與WANG[37]等的研究結果一致，蘋果酸在消化后被部分分解，含量降低?？Х纫蚝炕静蛔儯f明酶解消化對咖啡因含量影響不大。

表2 發(fā)酵時間對呈酸苦味前體物質的影響Table 2 The effect of fermentation time on the precusor substances of acid and bitter

2.5 發(fā)酵咖啡豆的杯品

從杯品總分來看，發(fā)酵2 h咖啡杯品較0 h高，差異不顯著(P>0.05)，發(fā)酵2 h咖啡干香、濕香及風味評分較高，咖啡香氣由美拉德反應和其他熱催化反應所形成，糖、蛋白質、氨基酸和酚類等化合物在咖啡香氣的形成中起著重要作用,是重要的香氣前體。發(fā)酵2 h風味豐富、杯品最高，發(fā)酵4 h咖啡酸質較高。發(fā)酵過程中體脂感波動變化，與理化分析結果中脂肪含量變化相對應。隨著消化時間增加杯品分呈現(xiàn)波動，但均比0 h杯品高。

表3 發(fā)酵時間對烘焙咖啡豆杯品的影響 單位：分Table 3 Effect of fermentation time on the coffee cup quality

2.6 烘焙發(fā)酵咖啡豆杯測指標與基本理化成分的相關性分析

發(fā)酵咖啡豆經烘焙后體脂感與多糖和灰分含量呈極顯著(P<0.01)和顯著負(P<0.05)相關，相關系數(shù)分別為0.887和0.820，咖啡中多糖和灰分含量增加會降低咖啡的醇厚感。余韻與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數(shù)為0.812，可溶性蛋白質豐厚的咖啡回味會略強?？Х鹊母?濕香氣、風味、酸質與咖啡基本理化成分之間相關性不大(P>0.05)?？Х鹊谋瓬y指標與總蛋白含量相關性不大，與胡雙芳等[38]研究一致。

表4 發(fā)酵咖啡杯測評分與基本理化成分的Pearson相關分析Table 4 Correlation analysis (Pearson correlation) between coffee cup quality and physicochemical components of coffee beans

2.7 烘焙發(fā)酵咖啡豆杯測指標與風味特征成分的相關性分析

發(fā)酵咖啡豆烘焙后的風味與綠原酸的含量呈極顯著(P<0.01)正相關，相關系數(shù)為0.982，綠原酸較高的咖啡豆風味明顯，較容易識別。酸質與檸檬酸和蘋果酸含量呈極顯著(P<0.01)正相關，相關系數(shù)分別為0.885、0.875，說明高含量檸檬酸和蘋果酸能給咖啡帶來豐富酸質感。體脂感與葫蘆巴堿和奎寧酸呈顯著(P>0.05)負相關，相關系數(shù)分別為0.828、0.823，咖啡中隨著葫蘆巴堿和奎寧酸含量增加，咖啡醇厚度下降。其他杯測指標與理化成分之間相關性不明顯(P>0.05)，咖啡的干/濕香氣、余韻與咖啡風味特征成分之間相關性不大。

表5 發(fā)酵咖啡杯測評分與呈酸苦味前體物的Pearson關系分析Table 5 Correlation analysis (Pearson correlation) between coffee cup quality and precursors substances of acid and bitter in coffee beans

3 結論

咖啡生干豆最佳復水時間為10～12 h，豆體內容物滲出較少,利于后期發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，多糖呈下降趨勢，還原糖含量逐漸上升，總蛋白含量先下降再上升最后下降；可溶性蛋白、酚類消化2 h后呈下降趨勢，脂肪含量在消化2 h后變化不顯著(P>0.05)；膳食纖維和灰分含量變化不顯著(P>0.05)。咖啡豆游離氨基酸中谷氨酸含量占比最高為20.76%,其次為天門冬氨酸、賴氨酸和亮氨酸。在不同發(fā)酵階段，游離氨基酸隨發(fā)酵時間的增減變化無規(guī)律。而咖啡中風味特征成分綠原酸和檸檬酸的含量隨發(fā)酵進行逐漸增加，蘋果酸含量減少，咖啡因含量基本不變?？Х戎芯G原酸會極顯著影響咖啡風味表現(xiàn)，檸檬酸和蘋果酸高低決定了咖啡的酸質，可溶性蛋白含量高低影響到咖啡余韻，多糖、灰分、葫蘆巴堿、奎寧酸過高則會降低咖啡杯品醇厚度。