周明，朱曉娟，堯梅香，盧劍青，陳卡卡，朱鳳妮，陳金印，沈勇根*

1(江西共青江中食療科技有限公司，江西 九江，332020)2(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌，330045)3(江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌，330000)4(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西 南昌，330045)

‘修水化紅’是贛西北九江市修水縣種植的一種特色甜橙，目前已有400多年的栽培歷史，其甜中帶酸、味道鮮美、香氣濃郁，且具有止咳、化痰、消炎、健胃等多種功效，皮可入藥，是修水縣乃至江南地區(qū)難得的特色保健水果[1]。通?！匏t’果實在8月初左右進入快速增長期，此時便陸續(xù)開始采摘‘修水化紅’果實并干制作為藥材，在10月底或11月初‘修水化紅’果實完全成熟，此時大量采摘果實鮮銷和干制。研究表明黃酮類物質(zhì)是柑橘果實中最重要的生物活性成分，從柑橘果實檢測出新橙皮苷、柚皮素、橙皮苷、柚皮素、橙黃酮、香蜂草苷、橘皮素等多種黃酮類物質(zhì)[2]，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗癌等多種生物活性[3]，且經(jīng)常作為評定柑橘果實食用及藥用品質(zhì)的主要指標(biāo)。

黃酮類物質(zhì)先后通過磷酸戊糖途徑、苯丙烷代謝途徑及黃酮合成代謝途徑在果實中進行積累。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸-CoA-連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase，4CL)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)等是黃酮類物質(zhì)合成積累途徑中的相關(guān)合成酶。其中G6PDH催化6-磷酸葡萄糖反應(yīng)轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時伴隨著還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生成，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶[4]。PAL是苯丙烷代謝的初始酶，催化L-苯丙氨酸反應(yīng)脫氨生成反式肉桂酸，其活性決定了L-苯丙氨酸的反應(yīng)速度及整個黃酮代謝通路的速率[5]。C4H催化植物苯丙烷代謝途徑中的第二步反應(yīng)，作用于肉桂酸對位羥基化反應(yīng)生成對香豆酸[6]。4CL作用于對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸類物質(zhì)反應(yīng)生成相應(yīng)的CoA硫酯，為一系列次生代謝產(chǎn)物提供前體物質(zhì)，其中對香豆酰-CoA直接進入黃酮類物質(zhì)的生物合成途徑中[7]。CHI是黃酮代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化查爾酮異構(gòu)化反應(yīng)生成柚皮素、圣草素等二氫黃酮[8]。研究表明，G6PDH、PAL、C4H、4CL、CHI等是影響植物黃酮類化合物合成積累相關(guān)性比較高的酶，在桃[9]、銀杏[10]、葡萄柚[11]、馬鈴薯[12]等植物中得到了驗證。目前關(guān)于黃酮類物質(zhì)在‘修水化紅’果實成熟過程中動態(tài)變化規(guī)律及其合成相關(guān)酶缺乏相關(guān)探索，同時果實成熟過程中的抗氧化能力變化規(guī)律鮮有報道。

基于上述研究背景，本試驗對2016年8月～10月不同成熟度的‘修水化紅’果實黃酮類物質(zhì)含量及合成相關(guān)酶活性與抗氧化能力的動態(tài)變化規(guī)律進行分析，并進行相關(guān)性分析，明確果實成熟過程中的黃酮積累特性及黃酮含量與相關(guān)酶活性、抗氧化能力之間的聯(lián)系與調(diào)控關(guān)系，為‘修水化紅’果實的黃酮質(zhì)量控制及資源開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘修水化紅’：采自江西省修水縣西港鎮(zhèn)‘修水化紅’基地，選擇樹勢和結(jié)果基本一致的果樹，于2016年8月10日～10月26日，每隔10 d，從樹冠中部外圍隨機采果，并當(dāng)天運回實驗室進行處理，挑選大小均一的果實并分離果皮、果肉(去果籽)，混合均勻，一部分進行液氮速凍置于-80 ℃超低溫冰箱保存，一部分置于55 ℃熱風(fēng)下干燥磨粉并過60目篩；蘆丁(純度≧98%)、柚皮苷(純度≧98%)、橙皮苷(純度≧98%)、新橙皮苷(純度≧98%)、L-苯丙氨酸、反式肉桂酸、P-香豆酸、查爾酮，北京索萊寶科技有限公司；乙腈(色譜純)，美國天地有限公司；DPPH、ABTS+，上海阿拉丁試劑有限公司；水楊酸、三氯化鐵，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sp-754PC紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮類物質(zhì)含量測定

‘修水化紅’總黃酮、橙皮苷的測定參照周明等[13]的方法進行。

1.3.2 黃酮相關(guān)酶活性的測定

G6PDH提取及活性測定參照AOKI等[14]的方法并修改。稱取適量‘修水化紅’樣品(果皮1 g，果肉2 g)，加入預(yù)冷的pH 8.5，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液10 mL(內(nèi)含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉與0.5 mmol/L二硫蘇糖醇)，后冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液測定G6PDH活性。100 μL上清液與3 mL pH 8.5，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含3 mmol/LD-葡萄糖-6磷酸二鈉，0.15 mmol/L氧化性輔酶Ⅱ鈉鹽與2 mmol/L MgCl2)混合，25 ℃水浴下培育3 min以蒸餾水為空白對照，于340 nm下測定吸光值。以單位時間吸光度變化值代表G6PDH活性，用U/(min·g FW)表示。

PAL提取及活性測定參照LI等[15]的方法并修改。稱取適量‘修水化紅’樣品(果皮1 g，果肉2 g)，加入預(yù)冷的pH 8.8，0.05 mol/L硼酸緩沖液10 mL(內(nèi)含0.05 mol/L β-巰基乙醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉與2%聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液測定PAL活性。取100 μL上清液與2 mL pH 8.8，0.05 mol/L 硼酸緩沖液、100 μL 0.02 mol/L苯丙氨酸溶液混合，置于37 ℃水浴下反應(yīng)30 min，后立即加入100 μL 6 mol/L HCl結(jié)束反應(yīng)，以蒸餾水為空白對照，于290 nm下測定吸光度。PAL活性以每小時變化0.01為1個酶活性單位U，表示為U/(h·g FW)。

C4H提取及活性測定參照LAMB等[16]的方法并修改。稱取適量‘修水化紅’樣品(果皮1 g，果肉2 g)，加入預(yù)冷的pH 8.9，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液10 mL(內(nèi)含15 μmol/L β-巰基乙醇，10 μmol/L亮抑肽酶，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，2.5 mmol/L VC，4 mmol/L MgCl2，0.15%聚乙烯吡咯烷酮與10%甘油)，冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液測定C4H活性。取50 μL上清液與2.95 mL pH 8.9，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含2 μmol/L反式肉桂酸，2 μmol/L氧化性輔酶Ⅱ鈉鹽及5 μmol/LD-葡萄糖-6磷酸二鈉)混合，置于25 ℃水浴下振蕩反應(yīng)30 min，后立即加入100 μL 6 mol/L HCl結(jié)束反應(yīng)，再4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11，以蒸餾水為空白對照，于340 nm下測定吸光度。C4H活性以每分鐘變化0.01為1個酶活性單位U，表示為U/(min·g FW)。

4CL提取及活性測定參照KNOBLOCH等[17]的方法并修改。稱取適量‘修水化紅’樣品(果皮1 g，果肉2 g)，加入預(yù)冷的pH 8.9，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液10 mL(內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮)，后冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液測定4CL活性。取100 μL上清液與3 mL pH 8.9，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含5 mmol/L P-香豆酸，1 μmol/L輔酶A、50 μmol/L 5-三磷酸腺苷二鈉及15 μmol/L MgSO4)混合，置于40 ℃水浴下反應(yīng)10 min，立即加入100 μL 6 mol/L HCl結(jié)束反應(yīng)，以蒸餾水為空白對照，于333 nm下測定吸光度。4CL活性以每分鐘變化0.1為1個酶活性單位U，表示為U /(min·gFW)。

CHI提取及活性測定參照LISTER等[18]的方法并修改。稱取適量‘修水化紅’樣品(果皮1 g，果肉2 g)，加入預(yù)冷的pH 7.0，0.05 mol/L 磷酸鉀緩沖液10 mL(內(nèi)含0.018 mol/L β-巰基乙醇和0.05 mol/L VC)，冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液測定CHI活性。取100 μL上清液與2 mL pH 7.4，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含7.5 mg/L牛血清蛋白和1%乙醇)、50 μL 1 mg/mL查爾酮乙醇溶液混合，置于34 ℃水浴下反應(yīng)30 min，后立即加入100 μL 6 mol/L HCl結(jié)束反應(yīng)，以蒸餾水為空白對照，于390 nm下測定吸光度。CHI活性以每分鐘變化0.001為1個酶活性單位U，表示為U/(min·g FW)。

1.3.3 抗氧化能力的測定

‘修水化紅’清除DPPH自由基、·OH、ABTS+·等能力及還原力的測定參照周明等[13]的方法進行。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013和Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理和作圖，SPSS 20.0進行ANOVA分析，采用Duncan′s新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗，各項結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘修水化紅’成熟過程中總黃酮、橙皮苷含量的變化

由圖1-A可知，隨著‘修水化紅’果實的成熟，果皮總黃酮含量一直在降低，8月10日果皮總黃酮含量最高，達15.01 mg/g DW，10月26日果皮總黃酮含量最低?！匏t’果肉總黃酮變化規(guī)律與果皮相類似，在10月26日總黃酮含量最低，僅為2.25 mg/g DW。在果實成熟期間，果肉總黃酮含量均顯著低于果皮(P<0.05)。如圖1-B所示，‘修水化紅’果皮與果肉在成熟過程中，橙皮苷含量均不斷降低，且果肉橙皮苷含量均顯著低于果皮(P<0.05)，10月26日時，果皮橙皮苷含量是果肉的2.4倍左右。

A-總黃酮含量；B-橙皮苷含量圖1 ‘修水化紅’成熟過程中果實總黃酮與橙皮苷含量變化Fig.1 The change of the total flavonoids and hesperidin content in ‘Xiushui Huahong’ during maturity of fruit注：不同小寫字母表示不同成熟期‘修水化紅’果皮、果肉組內(nèi)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一個成熟期下‘修水化紅’果皮與果肉組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 ‘修水化紅’成熟過程中G6PDH活性的變化

由圖2可知，‘修水化紅’果皮與果肉G6PDH活性在果實的成熟過程中總體呈現(xiàn)降低的趨勢，且果皮G6PDH活性均顯著高于果肉(P<0.05)。隨著果實的成熟，果皮G6PDH活性先下降，在9月12日和10月15日有略微的升高， 10月26日降到最低，僅為0.77 U/(min·g FW)。果肉G6PDH活性在8月21日有略微的升高，與8月10日差異顯著(P<0.05)，隨后降低至0.62 U/(min·g FW)，9月12日又增加至0.73 U/(min·g FW)。

圖2 ‘修水化紅’果實成熟過程中G6PDH酶活性變化Fig.2 The change of the G6PDH activity in ‘Xiushui Huahong’during maturity of fruit

2.3 ‘修水化紅’成熟過程中PAL活性的變化

從圖3中可以看出，隨著果實的成熟，果皮PAL活性一直在降低，8月21日～9月1日，果皮PAL活性下降速度最快，由375.87 U/(h·g FW)快速降低至270.97 U/(h·g FW)。果肉PAL活性在果實的成熟期間先降低，在9月12日有略微的升高，后又繼續(xù)下降至42.40 U/(h·g FW)，僅為8月10日的1/3左右。成熟過程中，果皮PAL酶活性均顯著高于果肉(P<0.05)，是果肉酶活性的3倍左右。

圖3 ‘修水化紅’果實成熟過程中PAL活性變化Fig.3 The change of the PAL activity in ‘Xiushui Huahong’during maturity of fruit

2.4 ‘修水化紅’成熟過程中C4H活性的變化

從圖4可以看出，‘修水化紅’果皮C4H活性在成熟過程中先由8月10日的38.97 U/(min·g FW)降低至25.87 U/(min·g FW)，后在9月12日有略微的升高，繼而繼續(xù)降低，在10月26日又有略微的升高，但與前一時期差異不顯著(P>0.05)。果肉C4H活性在果實成熟過程中呈降低的趨勢。成熟過程中‘修水化紅’果皮C4H活性均顯著高于果肉(P<0.05)，8月10日果皮C4H活性是果肉的3倍左右，到10月26日，果皮C4H活性是果肉的5倍左右。

圖4 ‘修水化紅’果實成熟過程中C4H活性變化Fig.4 The change of the C4H activity in ‘Xiushui Huahong’ during maturity of fruit

2.5 ‘修水化紅’成熟過程中4CL酶活性的變化

由圖5可知，隨著‘修水化紅’果實的成熟，果皮與果肉4CL酶活性均呈降低的趨勢。不同成熟期果皮4CL活性均顯著高于同時期的果肉酶活性(P<0.05)，是果肉的1.5倍左右。果皮與果肉4CL活性均在10月15日最低，分別是10.93 U/(min·g FW)、5.16 U/(min·g FW)，比8月10日的果皮、果肉分別低35.66%、54.70%。

圖5 ‘修水化紅’果實成熟過程中4CL酶活性變化Fig.5 The change of the 4CL activity in ‘Xiushui Huahong’ during maturity of fruit

2.6 ‘修水化紅’成熟過程中CHI活性的變化

由圖6可知，隨著果實的成熟，‘修水化紅’果皮和果肉CHI活性均一直在降低，果皮酶活性由8月10日的171.01 U/(min·g FW)降低至10月26日的104.10 U/(min·g FW)，果肉則由83.28 U/(min·g FW)降低至38.10 U/(min·g FW)，同時果皮酶活性均顯著高于同時期的果肉(P<0.05)。

圖6 ‘修水化紅’果實成熟過程中CHI活性變化Fig.6 The change of the CHI activity in ‘Xiushui Huahong’during maturity of fruit

2.7 ‘修水化紅’成熟過程中抗氧化能力的變化

隨著果實的成熟，‘修水化紅’果皮與果肉的DPPH自由基、·OH、ABTS+·清除率及還原力均表現(xiàn)出的降低趨勢，且果皮各指標(biāo)均顯著高于果肉(P<0.05)。

如圖7-A所示，‘修水化紅’果皮DPPH自由基清除率在9月23日與10月4日有較大的降幅，在10月26日有略微的升高，但與前一時期差異不顯著(P>0.05)；除9月1日與12日之間的果肉DPPH自由基清除率差異不顯著外(P>0.05)，其余時期之間都表現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)，并在10月26日降低速度最大，達13.73%。如圖7-B所示，‘修水化紅’果皮·OH清除率先降低至73.26%而后升高，再降低至69.65%，比8月10日低9.80%；果肉·OH清除率由8月10日的63.78%降低至10月26日的49.27%，降低幅度比果皮高。

由圖7-C可知，果皮ABTS+·清除率在8月21日、9月23日與10月15日均有略微的升高，但都與前一時期的清除率差異不顯著(P>0.05)，10月15日～10月26日ABTS+·清除率降低速度最大；果肉ABTS+·清除率在9月1日～9月23日期間降低速度較快，進入10月份后，果肉ABTS+·清除率差異不顯著(P>0.05)。如圖7-D所示，果皮還原力在9月12日和10月15日有略微的升高，10月15日后便大幅度降低至0.406；果肉還原力在成熟過程中先快速地降低至0.388，繼而升高，再快速降低，后在10月26日有略微升高。

A-DPPH自由基清除率；B-·OH清除率；C-ABST+·清除率；D-還原力圖7 ‘修水化紅’果實成熟過程中抗氧化能力變化Fig.7 The change of the antioxidant capacity in‘Xiushui Huahong’ during maturity of fruit

2.8 ‘修水化紅’果實黃酮含量與相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析

如表1和表2所示，果皮和果肉中的總黃酮含量、橙皮苷含量與G6PDH、PAL、C4H、4CL、CHI等合酶活性均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。果皮總黃酮含量與CHI活性相關(guān)系數(shù)最高，達0.947，其次是PAL，達0.910；果皮橙皮苷含量與PAL活性相關(guān)系數(shù)最高，達0.988，其次是CHI，達0.972。果皮中的黃酮相關(guān)酶活性之間都表現(xiàn)出顯著正相關(guān)(P<0.05)關(guān)系。果肉總黃酮含量、橙皮苷含量都與CHI活性相關(guān)系數(shù)最高，分別是0.973、0.956，其次是PAL，分別是0.938、0.941。果肉中的5個黃酮相關(guān)酶活性之間除了G6PDH與C4H，其他均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表1 ‘修水化紅’成熟過程中果皮總黃酮、橙皮苷含量與相關(guān)酶活性相關(guān)性分析Table 1 The correlation analysis between the total flavonoids，hesperidin content and related enzyme activity in‘Xiushui Huahong’ peel during maturity of fruit

表2 ‘修水化紅’成熟過程中果肉總黃酮、橙皮苷含量與相關(guān)酶活性相關(guān)性分析Table 2 The correlation analysis between the total flavonoids，hesperidin content and related enzyme activity in ‘Xiushui Huahong’ pulp during maturity of fruit

2.9 ‘修水化紅’成熟過程中黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

由表3與表4可知，果皮與果肉的總黃酮、橙皮苷含量與DPPH自由基、·OH、ABTS+·清除率及還原力均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。在果皮中，總黃酮、橙皮苷含量都與DPPH自由基清除率相關(guān)系數(shù)最大，分別為0.971、0.910。在果肉中，總黃酮含量與DPPH自由基清除率相關(guān)系數(shù)最大，達0.970，而橙皮苷含量與還原力相關(guān)系數(shù)最大，達0.956。

表3 ‘修水化紅’成熟過程中果皮總黃酮、橙皮苷含量與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis between the total flavonoids，hesperidin content and antioxidant capacity in ‘Xiushui Huahong’ peel during maturity of fruit

表4 ‘修水化紅’成熟過程中果肉總黃酮、橙皮苷含量與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 4 The correlation analysis between the total flavonoids，hesperidin content and antioxidant capacity in‘Xiushui Huahong’ pulp during maturity of fruit

3 討論

3.1 ‘修水化紅’成熟過程中黃酮含量變化分析及其開發(fā)利用

黃酮類化合物是柑橘果實含量最豐富的次生代謝產(chǎn)物。研究表明，黃酮物質(zhì)廣泛存在于柑橘類水果的皮、肉、汁及種子中，其中甜橙皮約占全果重的30%，但黃酮含量是最高的[19]。本試驗中，‘修水化紅’皮總黃酮和橙皮苷含量均高于同時期的果肉。ZHAO等[20]在研究紐荷爾臍橙橙皮苷分布時也發(fā)現(xiàn)橙皮苷主要積累在果皮中且果皮橙皮苷含量是果肉的7～8倍。柑橘果實成熟度不同，其黃酮含量也不同，柑橘幼果黃酮類物質(zhì)含量最高，隨著成熟度的增加，果實橙皮苷、柚皮苷等黃酮含量降低[21]。本研究中，‘修水化紅’在成熟過程中,其果皮和果肉總黃酮與橙皮苷含量一直在降低，與前人的研究相吻合。對比研究發(fā)現(xiàn)10月26日修水化紅橙皮苷含量均高于同時期左右采收的南豐蜜桔早熟系品種、新余蜜橘、臺灣椪柑、安岳尤力克檸檬[22-24]，因此在這些柑橘類水果中，‘修水化紅’皮是橙皮苷較好來源之一，我們可充分利用這一優(yōu)勢來開發(fā)富含黃酮類物質(zhì)的功能性食品。從總黃酮與橙皮苷含量的角度上，我們可以在8月初，果實開始進入膨大期進行采收。

3.2 ‘修水化紅’成熟過程中黃酮含量與相關(guān)酶活性的關(guān)系探討

G6PDH活性增強導(dǎo)致代謝產(chǎn)物苯丙氨酸含量增加和PAL活性增強[9]。PAL是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶，其與總酚、木質(zhì)素、生物堿與類黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)[25]。C4H控制黃酮類化合物前體物質(zhì)簡單酚的合成，4CL是苯丙烷代謝從主途徑進入分支途徑的關(guān)鍵酶，CHI控制苯丙烷代謝向黃酮類物質(zhì)合成的轉(zhuǎn)化，活性高伴隨著代謝產(chǎn)物類黃酮的大量積累。本研究結(jié)果顯示，‘修水化紅’果皮和果肉在成熟期間總黃酮、橙皮苷含量與G6PDH、PAL、C4H、4CL、CHI的活性變化趨勢一致，并呈極顯著正相關(guān)，表明這5種合成酶均是影響‘修水化紅’果皮與果肉黃酮物質(zhì)含量的重要酶，通過提高這些酶的活性可能促進‘修水化紅’黃酮的積累。果皮總黃酮含量與CHI活性相關(guān)系數(shù)最高，橙皮苷含量與PAL活性相關(guān)系數(shù)最高，果肉總黃酮與橙皮苷含量都與CHI活性相關(guān)系數(shù)最高，因此推測CHI與PAL是在‘修水化紅’果實黃酮合成中起著最主要作用的關(guān)鍵酶，但有待采用分子生物學(xué)方法進一步確認(rèn)。KONG等[26]在研究金銀花綠原酸積累與相關(guān)合成酶關(guān)系中發(fā)現(xiàn)在金銀花生長發(fā)育前期PAL、C4H、4CL與CHI活性變化趨勢一致，我們在‘修水化紅’中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，且‘修水化紅’果皮和果肉5種黃酮合成酶之間均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.7，有的存在顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明G6PDH、PAL、C4H、4CL、CHI之間可能存在相互協(xié)同和雙向調(diào)控的關(guān)系，最終促進‘修水化紅’果實黃酮積累。此外，‘修水化紅’果皮與果肉合成酶活性變化規(guī)律并不完全一致，且果皮5種合成酶活性均顯著高于果肉，這可能是‘修水化紅’果皮直接與外界環(huán)境相接觸，成熟過程中長期遭受非生物或生物脅迫促使合成酶活性增強、生成較多的黃酮物質(zhì)適應(yīng)環(huán)境壓力[27]。值得關(guān)注的是，‘修水化紅’5種黃酮合成酶活性在成熟過程中均呈降低的趨勢。前人結(jié)果顯示黃酮相關(guān)合成酶活性易受一些環(huán)境因子影響，強光、水分脅迫等在一定程度上會促進酶活性增強，‘修水化紅’果實成熟前期黃酮合成酶活性較高可能是受到季節(jié)性的強光輻射和土壤水分低的影響，成為維持果皮、果肉黃酮含量較高的一個原因[28]。綜上所述， G6PDH、PAL、C4H、4CL、CHI等合成酶活性減弱可能是果皮和果肉總黃酮、橙皮苷含量降低的主要原因。

3.3 ‘修水化紅’成熟過程中黃酮含量與抗氧化能力的關(guān)系

柑橘類果實是重要的天然抗氧化劑，所含的總酚、黃酮等植物化學(xué)物是其抗氧化能力的物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。BARROS等[30]在研究巴西佩拉與利馬甜橙抗氧化能力中發(fā)現(xiàn)，兩個品種的甜橙果皮DPPH自由基清除率及FRAP鐵離子還原力均顯著高于果肉，果皮是甜橙果實起抗氧化能力的主要組織，在‘修水化紅’中也得到了驗證?！匏t’果皮和果肉中的黃酮含量與抗氧化能力相關(guān)性分析顯示不論是果皮還是果肉，總黃酮、橙皮苷含量均與DPPH自由基、·OH、ABTS+·清除能力及還原力呈極顯著正相關(guān)，這表明黃酮物質(zhì)是‘修水化紅’果實發(fā)揮抗氧化能力的主要物質(zhì)，同時也印證了黃酮類化合物是‘修水化紅’果實主要的抗氧化成分。

4 結(jié)論

‘修水化紅’的果皮與果肉總黃酮及橙皮苷含量在果實成熟過程中均呈逐漸降低的趨勢，且果皮均顯著高于果肉。G6PDH、PAL、C4H、4CL、CHI在‘修水化紅’果實成熟過程中活性逐漸減弱，相關(guān)性分析表明，5種合成酶在果實總黃酮、橙皮苷的積累均發(fā)揮著重要的作用，且CHI與PAL起著最主要的作用，成熟過程中果實黃酮含量降低可能是由于相關(guān)合成酶活性減弱?！匏t’果皮及果肉清除DPPH自由基、·OH、ABTS+·能力與還原能力也隨著成熟度的增大而表現(xiàn)出逐漸下降的規(guī)律。相關(guān)性分析證明總黃酮、橙皮苷是‘修水化紅’果實主要的抗氧化成分。