問 馨，王宏剛，楊曉鐘

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 淮安 223300

腸道菌群不僅與人類的健康息息相關(guān)，還與許多疾病有關(guān)，包括炎癥性腸病[1]、結(jié)腸癌[2]、脂肪肝[3]等消化系統(tǒng)疾病以及代謝綜合征[4]、帕金森病[5]等非消化系統(tǒng)疾病。這些疾病可以歸納為腸道菌群失調(diào)相關(guān)疾病。這個(gè)概念雖不能反映疾病的整體特征，但從腸道菌群研究的角度來看，這類疾病的共有特征是腸道菌群失調(diào)。腸道菌群失調(diào)與疾病的因果關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)。研究腸道菌群最為基礎(chǔ)的是獲取菌群樣本以進(jìn)行分析。樣本的檢測(cè)分析技術(shù)在一定程度上影響了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著高通量擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的快速發(fā)展，腸道菌群的研究進(jìn)一步推動(dòng)了研究成果的臨床轉(zhuǎn)化。重視樣本的收集、儲(chǔ)存、檢測(cè)，有利于研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。

1 樣本收集

人類腸道中存在多種微生物，包括細(xì)菌、古菌、真菌、病毒，被稱為腸道微生物群。腸道微生物群在每個(gè)個(gè)體中都是獨(dú)一無二的，大多數(shù)(約80%)隨著時(shí)間的推移保持穩(wěn)定[6]。腸道微生物群主要由細(xì)菌組成，病毒和真菌只占了其中很小的一部分。因此，對(duì)腸道微生物群的研究，主要集中于腸道菌群。健康人體的腸道菌群處于動(dòng)態(tài)變化之中，且同一個(gè)體的具體菌株都有很大的變化[7]。但體內(nèi)菌群的波動(dòng)幅度與個(gè)體間菌群的差異相比，可以說是微乎甚微。腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化參與了人體的生長(zhǎng)發(fā)育[8]、代謝食物[9]、調(diào)節(jié)免疫[10]等重要生理功能。

研究腸道菌群可通過糞便、直腸拭子、腸黏膜、腸灌洗液等方式獲取樣本。糞便是很容易獲取的研究樣本，但糞便菌群不等于腸道菌群。糞便不能準(zhǔn)確地反映小腸和近端結(jié)腸的菌群，尤其是附著于腸黏膜的菌群。腸黏膜菌群也是腸道菌群的一部分，更能反映腸道病變部位的菌群變化，但需內(nèi)鏡下活檢取材腸黏膜，對(duì)腸道有些許損傷。腸黏膜菌群與遺傳因素有一定關(guān)聯(lián)，而糞便菌群受環(huán)境影響更顯著[11]。因此，利用糞便樣本難以對(duì)疾病部位的菌群進(jìn)行分析[12]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，糞便菌群與腸黏膜菌群可能存在很大差異[13]。但動(dòng)物腸道內(nèi)的菌群與人類腸道內(nèi)的菌群也有很大的差異[14]。直腸拭子是檢測(cè)遠(yuǎn)端腸道菌群組成的另一種方式。相比糞便樣本，直腸拭子簡(jiǎn)化了樣本收集和DNA提取的過程，但在菌群組成方面兩者很類似[15]。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸灌洗樣本在一定程度上反映了結(jié)腸活檢樣本菌群的組成。

經(jīng)內(nèi)鏡腸道植管術(shù)(transendoscopic enteral tubing，TET)是獲取腸內(nèi)容物樣本的一個(gè)好方法。結(jié)腸途徑TET是指在內(nèi)鏡輔助下植入細(xì)管并固定于回盲部，體外端沿腸道與外界相通，可長(zhǎng)時(shí)間保留于腸道內(nèi)[17]，為腸道深部給藥和腸道樣本的動(dòng)態(tài)獲取提供了新的方法[18]。TET管可以實(shí)現(xiàn)每天多次取樣，研究回盲部菌群及與晝夜節(jié)律的關(guān)系[18]。另外，不同腸道節(jié)段的菌群也存在差異[19]。我們建議在做腸道菌群研究時(shí)，需考慮菌群樣本的來源，包括宿主種屬(人或動(dòng)物)、樣本類型(糞便或腸黏膜)、取材部位(小腸或結(jié)直腸)等。保持樣本來源的均一性，有助于降低樣本間的干擾因素，提高可比性。

2 樣本儲(chǔ)存

獲取的樣本需在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存。Budree等[20]認(rèn)為糞便處理時(shí)間在3 h左右不會(huì)影響糞便菌群，但轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致糞便菌群發(fā)生改變[21]。研究者發(fā)明了GutAlive一次性糞便采集試劑盒，用于糞便采樣和運(yùn)輸，以確保包括厭氧菌在內(nèi)的糞便菌群的活力[22]。國內(nèi)也有多家醫(yī)療器械公司發(fā)明了菌群采樣器和樣本保存液，可常溫保存1周以上，保護(hù)糞便菌群DNA完整性，為菌群測(cè)序分析提供穩(wěn)定的樣本。常用的樣本儲(chǔ)存方法包括直接凍存和添加保護(hù)液(乙醇或RNA保護(hù)液)等。Vogtmann等[23]研究發(fā)現(xiàn)，糞便不適合儲(chǔ)存在70%的乙醇中，而95%乙醇可以充分保存糞便樣本。RNA保護(hù)液可以防止糞便樣本的RNA降解，但處理后的樣本難以進(jìn)行后續(xù)的代謝組學(xué)檢測(cè)。目前公認(rèn)的樣品儲(chǔ)存方法是凍存于-80 ℃冰箱[24]。在無保護(hù)液的情況下，糞便菌群在-20 ℃或4 ℃儲(chǔ)存8周內(nèi)變化均很小。如果在4 ℃儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致樣本中的真菌生長(zhǎng)[15]。但總體而言，個(gè)體間的菌群差異遠(yuǎn)超樣品儲(chǔ)存過程中的變化。因此，我們建議收集新鮮的糞便在-80 ℃快速冷凍作為最佳的儲(chǔ)存條件。如果在條件允許的情況下，可以考慮使用試劑盒對(duì)糞便樣本進(jìn)行儲(chǔ)存。

3 樣本檢測(cè)

3.1 細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)于已知培養(yǎng)條件的細(xì)菌，細(xì)菌培養(yǎng)仍是最敏感的檢測(cè)方法，可用于確定生長(zhǎng)條件顯微鏡觀察和耐藥性檢測(cè)[25]。人類腸道中85%以上的細(xì)菌是厭氧菌，因此需在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)[26]。樣本收集與處理的時(shí)間間隔對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)非常重要，建議盡量縮短樣本處理的時(shí)間[27]。雖然細(xì)菌培養(yǎng)方法已有很多進(jìn)步，但還是難以明確糞便中的哪些菌群可被培養(yǎng)，因?yàn)槿魏闻囵B(yǎng)條件均無法滿足細(xì)菌種類繁多的菌群樣本的培養(yǎng)要求[28]。另外，由于樣本易被污染，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果容易產(chǎn)生偏差。

3.2 擴(kuò)增子分析對(duì)腸道菌群的認(rèn)識(shí)是從擴(kuò)增子高通量測(cè)序開始的，這是目前常用的腸道菌群檢測(cè)方法。擴(kuò)增子分析的方法是對(duì)特定長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物或捕獲的基因片段進(jìn)行測(cè)序，如原核生物16S rRNA，真核生物18S rRNA或rDNA ITS。幾乎所有的細(xì)菌均有16S rRNA，它是一個(gè)高度保守的基因，常以多基因家族或操縱子的形式存在[29]。這些特定的遺傳物質(zhì)包括進(jìn)化保守性及進(jìn)化可變區(qū)，因此通過對(duì)可變區(qū)的測(cè)序分析，彌補(bǔ)細(xì)菌培養(yǎng)的缺點(diǎn)，獲得無法分離培養(yǎng)的物種信息，從而對(duì)樣本中菌群多樣性進(jìn)行全面的研究。擴(kuò)增子分析適合大規(guī)模樣本分析，但該方法受樣品收集和處理存在差異，難以建立通用的擴(kuò)增引物，分析方法不夠全面等因素的限制，無法準(zhǔn)確地反映樣品中菌群的結(jié)構(gòu)[30]。

3.3 宏基因組學(xué)隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和費(fèi)用的降低，越來越多的研究者采用宏基因組分析腸道菌群的分類和功能研究。與16S rRNA擴(kuò)增子分析不同，宏基因組還可用于研究樣本中真菌和病毒[31]。宏基因組測(cè)序可以評(píng)估任何菌群的全部基因組含量，實(shí)現(xiàn)精確的分類和準(zhǔn)確的功能分配[25，32]。宏基因組學(xué)的局限性主要在于不能區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌[33]?，F(xiàn)有的宏基因組數(shù)據(jù)可比性欠佳，原因在于缺乏含有效菌群分析參數(shù)的統(tǒng)計(jì)工具以及實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理中的人為偏差[34]。

3.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在宏基因組學(xué)之后興起的一門新學(xué)科，適用于分析特定環(huán)境、特定時(shí)期在某功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄的所有RNA的類型及拷貝數(shù)。這種技術(shù)不但具有宏基因組的優(yōu)點(diǎn)，還能反映群落的功能活性，所以它能夠捕捉菌群的動(dòng)態(tài)變化，從而對(duì)菌群整體進(jìn)行各種相關(guān)功能的研究。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠直接對(duì)轉(zhuǎn)錄的活性基因進(jìn)行檢測(cè)，著力于研究菌群功能基因的表達(dá)，為分析菌群的關(guān)鍵功能基因指明新的道路。個(gè)體間可以有很大的腸道菌群差異，而菌群基因表達(dá)和代謝通路卻是相對(duì)保守的，所以可以更顯著地提示疾病狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄組差異可能更好地顯示疾病相關(guān)的菌群變化[35]。相比于擴(kuò)增子分析，轉(zhuǎn)錄組更能分析菌群的功能變化[36]。但糞便菌群的轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定性可能差于宏基因組[37]。Schirmer等[38]研究炎癥性腸病患者的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)很多菌群雖然基因組豐度不太突出，但可能因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組水平高而對(duì)疾病起到?jīng)Q定性作用。這提示炎癥性腸病患者的菌群差異可能更多的在轉(zhuǎn)錄組層面。由此可見，轉(zhuǎn)錄組學(xué)比宏基因組學(xué)在某些疾病中有著特殊的優(yōu)勢(shì)。

3.5 代謝組學(xué)代謝組學(xué)是利用先進(jìn)的分析化學(xué)技術(shù)來綜合測(cè)量各種生物譜系中的代謝物，用于解釋腸道菌群生物活性的機(jī)制[39]。例如，糞便pH試紙就可以用來粗略測(cè)量糞便中脂肪酸的含量和乳糖耐受情況。代謝組學(xué)不僅能夠檢測(cè)出菌群修飾或生物合成的分子，而且還可以直接判斷影響腸道菌群的藥物和食物[40]。我國古代已有通過觀察糞便的顏色和聞氣味來評(píng)估患者健康的記載。代謝組學(xué)最常用的方法是通過色譜法分離代謝物，然后作為帶電離子進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜可以對(duì)腸道菌群的代謝物進(jìn)行定量檢測(cè)，靈敏度很高，甚至在含量很少的樣本中也可以進(jìn)行檢測(cè)。最近，新型軟電離生物質(zhì)譜的發(fā)展加快了對(duì)大分子的快速檢測(cè)，例如，MALDI Biotyper[41]是利用核糖體蛋白質(zhì)組指紋圖譜的方法來分析微生物，可以快速地對(duì)細(xì)菌、真菌、酵母菌進(jìn)行分類，適用于大多數(shù)腸道菌群的鑒定。但質(zhì)譜分析只能識(shí)別已知的菌群種類，加之檢測(cè)成本較高，很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。代謝組學(xué)與腸道菌群之間有密切的聯(lián)系。血液代謝組學(xué)可以預(yù)測(cè)腸道菌群的多樣性[42]，這提示各組學(xué)之間可能存在關(guān)聯(lián)性。

各組學(xué)聯(lián)合使用可以更全面地評(píng)估腸道菌群，在生理、病理、藥理等方面具有重要意義[43]。但多種分析方法可能會(huì)產(chǎn)生不同的研究結(jié)果，這可能與樣本的收集和儲(chǔ)存，所使用的檢測(cè)技術(shù)以及樣本量不同有關(guān)。在不同的研究中，應(yīng)注意選擇適合腸道菌群圖譜的技術(shù)方法。

4 討論

隨著對(duì)腸道菌群不斷深入的研究，我們對(duì)菌群與疾病的認(rèn)識(shí)已發(fā)生了從相關(guān)到因果的轉(zhuǎn)變。未來，樣本收集和儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)化以及多組學(xué)的聯(lián)合分析，將進(jìn)一步揭示腸道菌群研究在多學(xué)科疾病中的重要意義。腸道菌群失調(diào)相關(guān)疾病這個(gè)概念與多學(xué)科疾病整合觀相吻合。包括洗滌菌群移植在內(nèi)的重建腸道菌群的技術(shù)體系已成為這類疾病的前沿性治療方法[44-45]。基于此，重視腸道菌群研究的樣本收集、儲(chǔ)存、檢測(cè)，將進(jìn)一步促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化。