司徒寶珠

惠州市中醫(yī)醫(yī)院(惠州 516000)

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是介于細菌與病毒之間的兼性厭氧微生物[1]，其引起的肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)約占非細菌性肺炎的30%，約占兒童社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的20%[2]。MPP病情較輕，一般表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、乏力等，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素效果好。但近年來MP感染所致的大葉性肺炎(croupous pneumonia)逐漸增多，且MP耐藥率隨著抗菌藥物的不合理應(yīng)用不斷升高，導(dǎo)致部分病例治療棘手[3]。因此，探索一種有效方法對MPP患兒療效實時監(jiān)測具有重要的臨床意義。目前，臨床最常用的診斷MP感染方法為血清MP抗體(MP-Ab)檢測，但其陽性率易受患兒機體免疫狀態(tài)、年齡、病程等因素干擾，無法準確反映藥物療效和預(yù)后[4]。國外相關(guān)研究報道[5]，具有無創(chuàng)性、操作簡單和快速等特點的RNA實時熒光恒溫擴增技術(shù)(SAT)可直接以肺炎支原體RNA為靶標進行恒溫擴增檢測，已成功應(yīng)用于腸道輪狀病毒(rotavirus，RV)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)、泌尿生殖道沙眼衣原體(C.trachomatis)等病原的檢測，然而SAT應(yīng)用于MPP患兒檢測尚未見報道。故本研究將肺炎支原體RNA實時熒光恒溫擴增技術(shù)(MP-SAT)應(yīng)用于MPP患兒治療效果的監(jiān)測，旨在探討該方法的可行性和應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，選擇2017年10月—2018年10月我院兒科收治的因CAP住院的患兒178例作為研究對象，將其分為MPP組(n=80例)與非MPP組(n=98例)。納入標準：①符合《實用兒科學(xué)》第7版和“兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013年修訂版)中MPP診斷標準[3]；②肝、腎功能正常；③近2個月內(nèi)無腸道及上呼吸道感染；④均取得患兒家長的知情同意；⑤心電圖正常。排除標準：①合并風濕性疾病或肺結(jié)核；②免疫功能低下；③首次MP-SAT陽性但未行復(fù)測的患兒；④病例資料不完整。MPP組：男患兒43例，女患兒37例，年齡(5.83±2.68)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)為(13.27±6.21)kg·m- 2；非MPP組：包括細菌性肺炎32例，百日咳10例、病毒性肺炎52例，細菌和病毒混合感染肺炎4例；男患兒47例，女患兒51例，年齡(5.97±2.34)歲，BMI為(13.09±6.75)kg·m- 2。兩組患兒年齡、性別、BMI等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

①MP-Ab滴度測定：采集所有患兒入院當日外周靜脈血4 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清后采用顆粒凝集法檢測MP抗體，MP-Ab滴度≥1:160判讀為陽性。②MP-SAT檢測：醫(yī)用棉簽(深圳市科林姆科技有限公司)取咽部分泌物，將拭子頭置于1 mL生理鹽水(珠海市司邁科技有限公司)浸泡貼管壁擠干，取500 μL生理鹽水加入至1.5 mL離心管(北京研勤科技有限公司)中，再加入500 μL裂解液(北京伯邁科技有限公司)，震蕩混勻，應(yīng)用MP-SAT試劑盒(海仁度生物科技有限公司)提取待測樣本RNA，后轉(zhuǎn)至熒光定量PCR儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)擴增。反應(yīng)程序：熒光通道設(shè)定為FAM，42 ℃ 1分鐘為一個循環(huán)，共40循環(huán)；熒光信號1分鐘采集1 次，共采集40次；從40 ℃～80 ℃行溶解曲線分析，樣本曲線與閾值曲線交叉點的橫坐標讀數(shù)(監(jiān)測時間)為dt，dt>40 min為陰性，dt≤35 min為陽性。③MPP治療方案：給予10 mg·kg-1注射用阿奇霉素(海南海靈化學(xué)制藥有限公司，國藥準字H20020254)靜脈滴注，1次/d，連續(xù)治療28 d。

1.3 評價項目

①統(tǒng)計分析178例CAP患兒MP-SAT和MP-Ab檢測結(jié)果；②分析MP-SAT和MP-Ab診斷MPP的準確性；③MP-SAT與MP-Ab在患兒不同治療時間點(入院后<24 h、7 d、21 d、28 d時)的檢出率；④MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與臨床痊愈時間的相關(guān)性。臨床痊愈標準：發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀消失，胸部X線好轉(zhuǎn)，實驗室指標[白細胞(white blood cell，WBC)計數(shù)、淋巴細胞(lymphocyte)百分比、中性粒細胞(neutrophils)百分比、超敏C反應(yīng)蛋白(High sensitive C reactive protein，hs-CRP)水平、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平]檢查結(jié)果恢復(fù)正常；⑤MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與MPP患兒臨床癥狀、實驗室指標及X線胸片的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，計量資料比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 178例CAP患兒MP-SAT和MP-Ab檢測結(jié)果

MPP組僅有MP-Ab陽性23例(28.75%)，僅有MP-SAT陽性25例(31.25%)，MP-SAT、MP-Ab均為陰性4例(5.00%)，MP-SAT、MP-Ab均為陽性28例(35.00%)，MPP組MP-SAT、MP-Ab結(jié)果不一致的比例為60.00% (48/80)。非MPP組僅有MP-Ab陽性17例(28.75%)，僅有MP-SAT陽性2例(31.25%)，MP-SAT、MP-Ab均為陰性79例(5.00%)，MP-SAT、MP-Ab均為陽性0例(35.00%)，非MPP組MP-SAT、MP-Ab結(jié)果不一致的比例為19.39%(19/98)，見表1。

表1 178例CAP患兒MP-SAT和MP-Ab檢測結(jié)果(例)

2.2 MP-SAT和MP-Ab診斷MPP的準確性分析

MP-SAT診斷MPP的敏感性略高于MP-Ab，無差異(P>0.05)；MP-SAT診斷MPP的特異性高于MP-Ab，有差異(P<0.05)；MP-SAT診斷MPP的陽性預(yù)測值高于MP-Ab，有差異(P<0.05)；MP-SAT診斷MPP的陰性預(yù)測值略高于MP-Ab，無差異(P>0.05)，見表2。

表2 MP-SAT和MP-Ab診斷MPP的準確性分析

2.3 MP-SAT和MP-Ab在不同治療時間點MP檢出率

見表2，MP-SAT和MP-Ab同時陽性28例。MP-SAT檢出率隨治療時間的延長降低(P<0.05)；MP-Ab檢出率隨治療時間的延長升高(P<0.05)；14 d時MP-SAT與MP-Ab檢出率比較，無差異(P>0.05)；<24 h、7 d、21 d、28 d時MP-SAT與MP-Ab檢出率比較，有差異(P<0.05)，見表3。

表3 MP-SAT和MP-Ab在不同治療時間點MP檢出率 n(%)

2.4 MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與臨床痊愈時間的相關(guān)性

28例MP-SAT和MP-Ab同時陽性的病例臨床痊愈時間為(3.11±0.88)周，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間為(3.25±0.74)周，無差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 MP-SAT臨床痊愈時間與轉(zhuǎn)陰時間比較

2.5 MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與MPP患兒臨床癥狀、實驗室指標及X線胸片的相關(guān)性

MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間越長的病例表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)時間越長，X線胸片肺大片實變比例越高，CRP水平越高，LDH水平越高，中性粒細胞百分比越高，淋巴細胞百分比越低，7 d、14 d、21 d、28 d、35 d五個MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間點間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與MPP患兒臨床癥狀、實驗室指標及X線胸片的相關(guān)性

3 討 論

MPP是由MP引起的肺部急性炎癥，也是5歲以下兒童死亡的首位病因。Wang L等[6]認為與患者對病原體或其代謝產(chǎn)物的過敏反應(yīng)有關(guān)。MPP起病較緩慢，潛伏期15～20 d，病初多表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、食欲不振、陣發(fā)性刺激性嗆咳等，后期咳嗽伴有黃色粘痰及少量血絲，嚴重者可造成凝血功能紊亂及神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚黏膜、胃腸道損害[7- 8]。既往臨床資料顯示[9-10]，早期適當應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可減輕癥狀及縮短病程，但MP感染人體后癥狀不典型，使部分MPP診斷不明確，導(dǎo)致抗生素的不合理應(yīng)用，從而使大部分抗生素的耐藥率居高不下，給支原體肺炎早期診斷及后期治療帶來困難。因此，尋找一種操作簡便、快速直接的方法檢測MPP治療效果有益于提升患兒預(yù)后。MP-SAT是新一代RNA活菌檢測技術(shù)，是在RNA-SAT和實時熒光檢測技術(shù)基礎(chǔ)上建立的，具有無創(chuàng)性、窗口期短、操作簡單、快速準確的特點，能即時反映MP感染情況，可輔助MPP早期診斷及療效觀察，且兒童依從性相比需有創(chuàng)操作的MP-Ab更好，故近年來已成功應(yīng)用于腸道RV、泌尿生殖道C.trachomatis、MTB等病原的檢測[11]。MP-SAT陽性可提示MP近期感染，而不是既往感染，其原因在于RNA僅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，而該方法可快速區(qū)分“死菌”和“活菌”[12]。本研究選取臨床診斷為CAP的178例患兒為研究對象，包括80例MPP，其中MP-SAT、MP-Ab均為陰性4例(5.00%)，可能入院前有阿奇霉素治療史；98例非MPP，其中MP-Ab(+)17例，RNA-SAT(+)2例，其抗體滴度均<1:160。分析MP-SAT和MP-Ab診斷MPP的準確性發(fā)現(xiàn)，MP-SAT檢測的敏感度和特異度分別為65.00%(52/80)、97.96%(96/98)，提示MP-SAT具有較好的診斷價值，陰性可排除MP感染，同時MP被殺滅后RNA快速降解，提示其可用于MPP療效監(jiān)測。Li W等[13]報道以熒光定量PCR為參照，MP-SAT的敏感度(83.45%)明顯高于本研究(65.00%)，而特異度(98.33%)與本研究(97.96%)相近。分析其原因，認為可能與定量PCR產(chǎn)生的假陰性有關(guān)。Ying D等[14]研究RNA-SAT診斷MP感染的敏感度和特異度分別為72.96%和95.69%。造成不同研究MP-SAT檢測敏感度和特異度不同的原因主要是對非MPP真陰性和MPP真陽性納入標準不同，本研究納入標準均以患兒出院后最終綜合臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、影像學(xué)檢查為準，最大限度排除了假陽性和假陰性，所得結(jié)果更為可靠。此外，本研究還顯示了MPP組MP-SAT、MP-Ab結(jié)果不一致的比例為60.00% (48/80)，非MPP組MP-SAT、MP-Ab結(jié)果不一致的比例為19.39%(19/98)，提示MP-SAT、MP-Ab在MPP診斷中的一致性較差。

隨后，本研究分析了MP-SAT和MP-Ab在不同觀察時點MP檢出率，發(fā)現(xiàn)MP-SAT陽性率隨治療時間延長顯著降低，而MP-Ab陽性率隨治療療程延長其滴度反而持續(xù)升高，在入院后<24 h、7 d時的陽性率較低(分別為57.14%、64.29%)，在14 d、21 d、28 d時其陽性率顯著升高(分別為96.43%、100%、100%)。目前，抗生素停藥主要依據(jù)臨床癥狀、體征、炎性指標恢復(fù)正常，對臨床痊愈有一定提示意義，但仍缺乏客觀的停藥指征。本研究結(jié)果顯示，28例MP-SAT和MP-Ab同時陽性的病例臨床痊愈時間為(3.11±0.88)周，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間為(3.25±0.74)周，提示臨床痊愈時間與MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間無相關(guān)性，說明MP-SAT動態(tài)變化可為療效監(jiān)測提供依據(jù)。有研究認為[15]MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間長可能與體內(nèi)存在較強的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。為此，本研究還探討了MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與MPP患兒臨床癥狀、實驗室指標及X線胸片的相關(guān)性，結(jié)果顯示MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間越長的病例表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)時間越長，X線胸片肺大片實變比例越高，CRP水平越高，LDH水平越高，中性粒細胞百分比越高，淋巴細胞百分比越低，提示MP-SAT轉(zhuǎn)陰時間與MPP患兒臨床癥狀、實驗室指標及X線胸片有相關(guān)性。我們猜測這種結(jié)果可能與MP感染后免疫抑制有關(guān)，淋巴細胞百分比越低者可能對肺炎支原體更易感，提示針對發(fā)熱持續(xù)時間長、X線胸片肺大片實變比例高、CRP及LDH水平高、中性粒細胞百分比高、淋巴細胞百分比低者，適當延長其療程可能會減輕相關(guān)臨床癥狀，改善MPP患兒預(yù)后。

綜上，MP-SAT作為新一代RNA活菌檢測技術(shù)在支原體肺炎患兒療效監(jiān)測中有較高的價值，值得推廣。