王鑫荃 龐澤星 吳逸釗 劉淇興 區(qū)鍶文 余印林 王桂房 許小洋,3

1.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，廣東廣州 511436；3.廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣東廣州 511436

近年來，應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)病率逐漸升高，常引起出血、休克甚至死亡等嚴(yán)重后果，其發(fā)病與機(jī)體內(nèi)氧自由基系統(tǒng)生成和清除調(diào)節(jié)機(jī)制失衡有關(guān)，抗氧化物質(zhì)可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)自由基生成和清除之間的平衡，利于胃潰瘍愈合[1-4]。深海魚油富含n-3 多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs），其中二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）可作為自由基的清除劑，具有抗炎和抗氧化作用。EPA 和DHA 可通過限制炎性細(xì)胞游走和炎癥介質(zhì)、核因子κB（NF-κB）途徑和Toll 樣受體等途徑抑制炎癥[5-7]。本研究構(gòu)建應(yīng)激性胃潰瘍大鼠模型，并觀察深海魚油的干預(yù)效果，初步探討深海魚油抑制應(yīng)激性胃潰瘍的可能機(jī)制，為應(yīng)激性胃潰瘍的預(yù)防及治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

24 只成年SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，體重（200±10）g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（動物使用許可證號：SYXK（粵）2016-0168，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002）。動物實(shí)驗(yàn)均遵循廣州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員要求進(jìn)行。

1.2 藥品、試劑與儀器

1.2.1 試劑 深海魚油（美國GNC，純度：90.96%，批號：1600CR0662）；SOD 試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A001-1）；蘇木精-伊紅（HE）染液（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，貨號：YLYLSMJ-003）。

1.2.2 儀器 分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司，型號：722S）；臺式低速自動離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司，型號：TDZ4-WS）；數(shù)顯三用恒溫水箱（金壇市精達(dá)儀器制造有限公司，型號：HH-420）；冰凍切片機(jī)（Leica，型號：CM1950）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 深海魚油灌胃處理 依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將24 只大鼠分成對照組、模型組和魚油組，每組8 只，雌雄各半。給藥劑量參照李亞潔等[8]和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。對照組和模型組處理：適宜的環(huán)境條件下養(yǎng)殖5 d，按0.84 mL/kg 灌胃0.9%氯化鈉溶液，2 次/d；魚油組：相同的養(yǎng)殖環(huán)境條件下連續(xù)5 d 按0.84 mL/kg 灌胃深海魚油，2 次/d。實(shí)驗(yàn)前1 天均禁食不禁水24 h。

1.3.2 束縛水浸應(yīng)激法建立大鼠胃潰瘍模型 末次灌胃1 h 后，模型組和魚油組束縛水浸法建立大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型。束縛大鼠四肢背位固定于木板上，垂直立于水中12 h，水位與胸骨劍突齊平，水溫控制在（21±1）℃[9]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本獲取 麻醉后心臟采血，解剖暴露胃，結(jié)扎幽門和賁門，經(jīng)賁門端向胃內(nèi)注射1～2 mL 甲醛固定液，摘下全胃，甲醛固定后取出胃，沿大彎剪開，沖洗，展平觀察。若模型組大鼠胃部出現(xiàn)沿血管走行分布，呈點(diǎn)狀或條索狀，淺表，提示造模成功[10-11]。

1.3.4 組織切片檢測 各組選取大小合適組織于4%多聚甲醛固定后包埋，切片，片厚8 μm，將切片貼附于專用載片上，行HE 染色，鏡下觀察胃黏膜表面上皮完整性、腺體排列情況。

1.3.5 胃潰瘍指數(shù)（UI）檢測 采用Guth 等[12]記分法：全胃各病灶長度之和為UI，病灶長度≤1 mm 為1 分；1 mm<糜爛長度≤2 mm 為2 分，2 mm<糜爛長度≤3 mm 為3 分，3 mm<糜爛長度≤4 mm 為4 分，若病灶長度>4 mm 則分段計(jì)數(shù)。若病灶寬度>2 mm 則將其計(jì)數(shù)加倍；若其長度與寬度均<1 mm 者記0.5 分。

1.3.6 血清超氧化物歧化酶（SOD）檢測 采用可見分光光度計(jì)（550 nm）并根據(jù)SOD 試劑盒提供的方法測定血清SOD 值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SigmaPlot 12.5 for windows 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃部黏膜損傷情況

對照組大鼠胃黏膜光滑透亮，黏膜皺襞清晰；模型組大鼠胃黏膜沉暗，黏膜皺襞斷裂，胃黏膜表面出現(xiàn)比較集中的潰瘍點(diǎn)且潰瘍寬度甚至＞1 mm；魚油組表面胃黏膜顏色相對清亮光滑，黏膜皺襞部分出現(xiàn)斷裂，潰瘍點(diǎn)散在分布，數(shù)量較少，潰瘍寬度＜1 mm。見圖1。

圖1 深海魚油對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃黏膜的作用

2.2 大鼠胃部黏膜病理組織HE 染色結(jié)果

對照組大鼠的胃黏膜完好無損；模型組及魚油組大鼠胃黏膜均出現(xiàn)缺損，但魚油組黏膜缺損僅發(fā)生在黏膜淺層，其損傷程度輕于模型組。見圖2。

圖2 大鼠胃黏膜組織切片HE 染色結(jié)果（100×）

2.3 三組UI、血清SOD 水平比較

三組UI、SOD 水平比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。模型組UI 高于對照組；魚油組UI 低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P <0.01）。模型組SOD 水平低于對照組；魚油組SOD 水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05 或P <0.01）。見表1。

表1 三組UI 指數(shù)比較（）

表1 三組UI 指數(shù)比較（）

注：與對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。UI：潰瘍指數(shù)；SOD：超氧化物歧化酶

3 討論

應(yīng)激性胃潰瘍的潛在發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與體內(nèi)氧自由基的生成和清除系統(tǒng)失衡、下丘腦垂體腎上腺功能反應(yīng)和ghrelin 調(diào)控等多因素參與有關(guān)，故探究其發(fā)病機(jī)制能有效預(yù)防和治療的藥物至關(guān)重要[13-17]。深海魚油作為近年備受關(guān)注的保健品，其主要生理活性成分n-3 PUFAs，其中DHA 和EPA 是人體不能自身合成且對人體健康具有重要作用的多不飽和脂肪酸，具有調(diào)脂、抗炎等功效[18-19]。

束縛水浸應(yīng)激法造模時間短、成功率高[14]。經(jīng)造模后，模型組胃黏膜紋理紊亂且有多處出血點(diǎn)，鏡下胃黏膜缺損，提示造模成功。深海魚油能有效降低應(yīng)激性大鼠UI，鏡下胃黏膜病理變化改善，提示深海魚油可能通過某種機(jī)制有效保護(hù)應(yīng)激狀態(tài)下的胃黏膜。

EPA 和DHA 可作為抗氧化增強(qiáng)因子，調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)，抵御炎癥性損害[20]。DHA 和EPA 能下調(diào)天冬氨酸蛋白水解酶家族活性，同時抑制凋亡基因Bax 表達(dá)水平及促進(jìn)Bcl-2 基因的表達(dá)而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)[21-23]。本實(shí)驗(yàn)組認(rèn)為深海魚油的抗胃潰瘍效應(yīng)可能與EPA 和DHA 提高胃部SOD 活性而加快氧自由基的清除有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組SOD 水平低于對照組（P <0.01），提示氧化應(yīng)激系統(tǒng)參與了應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生，這可能是機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，胃部血管收縮效應(yīng)引起抗氧化酶系統(tǒng)活性下降，大量自由基生成，損傷胃黏膜，又促進(jìn)自由基進(jìn)一步生成，由此形成惡性循環(huán)[24-26]。魚油組SOD 水平高于模型組（P <0.05），提示深海魚油能夠提高SOD 的活性，顯著增強(qiáng)大鼠體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，大幅度降低胃潰瘍的氧化應(yīng)激，從而起到清除部分自由基，防止自由基對胃黏膜造成嚴(yán)重?fù)p傷[26]。

在深海魚油抗胃潰瘍機(jī)制探討中，本研究只涉及其對SOD 活性的影響觀察，對其詳細(xì)的分子機(jī)制尚未涉及，這是本研究不足之處。但本研究為今后深入探究深海魚油的抗胃潰瘍效應(yīng)奠定了良好的前期基礎(chǔ)。

綜上所述，深海魚油具有顯著抗應(yīng)激性潰瘍的效應(yīng)，其機(jī)制可能是通過EPA 和DHA 提高胃組織的SOD 活性而加快自由基清除有關(guān)。雖然其詳細(xì)分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探討，但本研究為胃潰瘍預(yù)防和治療提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。