焦翠王儉妹周雪穎況海霞劉輝保柳濤

(1. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科,南昌 330006; 2. 新余市婦幼保健院兒科,江西 新余 338025)

p53 基因位于人類染色體17p13.1,可調(diào)控多種基因和microRNA 的表達(dá),在細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激如DNA 損傷和缺氧等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,對(duì)維持生物的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要[1]。自1979年被發(fā)現(xiàn)以來(lái),p53 作為一種抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。近年來(lái),越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注p53 基因在神經(jīng)精神性疾病中的作用,機(jī)制與調(diào)控神經(jīng)管發(fā)育[2]、突觸可塑性[3]、神經(jīng)元分化和軸突再生[4]等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),孤獨(dú)癥患兒外周血單核細(xì)胞p53 基因復(fù)制比率增高[5];阿爾茨海默病患者的成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞中p53 蛋白構(gòu)象改變,使蛋白功能受損、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)水平降低,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[6-7];帕金森小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中多巴胺能神經(jīng)元p53 基因缺失時(shí),通過(guò)下調(diào)促凋亡基因-Bax、Puma表達(dá),增加神經(jīng)元存活,產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[8]。雖然p53 基因在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用已經(jīng)被初步認(rèn)識(shí),但是對(duì)其研究多集中于體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞及分子機(jī)制,而p53 基因缺失對(duì)動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)的影響的研究較少,且結(jié)果存在分歧。如Amson 等[9]研究發(fā)現(xiàn),p53 基因敲除(KO)小鼠存在焦慮樣行為,而Campana 等[10]研究結(jié)果則相反。因此,我們利用p53 基因敲除小鼠,探討了p53基因缺失對(duì)小鼠的焦慮樣行為和工作記憶能力等神經(jīng)行為學(xué)及相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)目的影響,以期為深入研究p53 基因在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 ～12周齡SPF 級(jí)p53 基因純合敲除(KO)(C57BL/6-Trp53tm1/Bcgen)小鼠45 只及野生型(WT)小鼠(C57BL/6)38 只,雌雄不拘,體重18 ～25 g,均為C57BL/6 背景,購(gòu)于北京百奧賽圖公司【SCXK(京)2019-0001】,飼養(yǎng)于我校動(dòng)物中心【SYXK(贛)2015-0001】。動(dòng)物房維持12 h:12 h 的晝夜循環(huán)(7:00 ～19:00),室溫23 ～25℃,濕度50%,可自由獲取食物和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作嚴(yán)格遵守《南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》及《南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查》(倫理審批號(hào)2017(009))。

1.1.2 主要試劑與儀器

尼式染色液(Solarbio,中國(guó))。曠場(chǎng)、Y 迷宮、紋理辨別實(shí)驗(yàn)裝置(自制), 石蠟切片機(jī)(Leica RM2245,德國(guó)),包埋機(jī)(Leica GE1150H,德國(guó)),機(jī)械對(duì)流烤箱(Thermo scientific 51028873,美國(guó)),圖像導(dǎo)航掃描儀(Olympus FSX100,日本),Matlab R2016b 分析軟件(MathWorks,美國(guó)),Image-Pro Plus 6.0 分析軟件(Media Cybernetics,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OF)

本實(shí)驗(yàn)用于評(píng)測(cè)焦慮情緒與自發(fā)活動(dòng)。開(kāi)闊曠場(chǎng)大小為50 cm × 50 cm × 25 cm(長(zhǎng)× 寬×高)[11],攝像頭置于盒子正上方,光照強(qiáng)度為300 Lux 左右。隨機(jī)選取野生型小鼠18 只、p53 基因敲除14 只小鼠進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。測(cè)試時(shí)將小鼠放置于曠場(chǎng)中心(中心點(diǎn)至各邊15 cm 以內(nèi)),任其自由活動(dòng)10 min。觀察指標(biāo)為小鼠在曠場(chǎng)中心活動(dòng)的時(shí)間及運(yùn)動(dòng)總路程。用Matlab R2016b 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)析。測(cè)試室溫度23 ～25℃,時(shí)間為8:00 ～17:00,每組測(cè)試結(jié)束后,用酒精擦洗盒子后再進(jìn)行下一只實(shí)驗(yàn)鼠的檢測(cè)。

1.2.2 Y 迷宮實(shí)驗(yàn)(Y-maze test,YM)

本實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)工作記憶能力。測(cè)試盒為臂長(zhǎng)40 cm、寬10 cm、高25 cm 的三臂水平迷宮[12],攝像頭置于盒子正上方,光照強(qiáng)度為300 Lux 左右。隨機(jī)選取野生型小鼠12 只、p53 基因敲除14 只小鼠進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。測(cè)試時(shí)將小鼠放置在其中一臂末端,并使其鼻側(cè)朝向迷宮的中心,自由活動(dòng)5 min。觀察指標(biāo)為小鼠進(jìn)入臂的總次數(shù)及自發(fā)交替率。用Matlab R2016b 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)析。小鼠按順序依次進(jìn)入三個(gè)臂為交替一次,計(jì)算公式為:交替率=交替次數(shù)/(進(jìn)入臂的總次數(shù)-2)×100%。分析軟件、測(cè)試條件及處理同1.2.1。

1.2.3 紋理辨別實(shí)驗(yàn)(texture discrimination task,TDT)

本實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估觸須敏感性[13]。測(cè)試盒與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相同,但測(cè)試時(shí)盒子底部覆蓋以2 cm 厚的常規(guī)墊料,另有目標(biāo)物a、b、c、d,0.5 cm × 15 cm × 4 cm(厚× 長(zhǎng)× 寬),固定于4 cm × 4 cm 底座上。氧化鋁砂紙覆蓋在目標(biāo)物底座上方2 cm 處,覆蓋高度為7.5 cm,繞目標(biāo)物一周。a、b、c 的砂紙為80 目,d 的砂紙為100 目[13]。為盡量減少不同砂紙之間的視覺(jué)差異,光照強(qiáng)度調(diào)弱為50 Lux 左右。隨機(jī)選取野生型小鼠12 只、p53 基因敲除7 只小鼠進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)期和測(cè)試期,共3 d。適應(yīng)期(2 d)每天把小鼠放入不含目標(biāo)物、覆蓋墊料的測(cè)試盒中,自由適應(yīng)10 min。測(cè)試期(第3天)包括兩個(gè)階段—學(xué)習(xí)階段和測(cè)試階段。測(cè)試當(dāng)天,先在盒子底部覆蓋墊料,再放入目標(biāo)物a 和b,目標(biāo)物底部埋入墊料中。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼻側(cè)背離目標(biāo)物放入盒中,自由探索5 min,此為學(xué)習(xí)階段。然后將實(shí)驗(yàn)小鼠移至一個(gè)覆蓋干凈墊料的中轉(zhuǎn)籠中過(guò)渡5 min,與此同時(shí)將目標(biāo)物a 和b 換成c 和d,再次將動(dòng)物鼻側(cè)背離目標(biāo)物放入盒中,測(cè)試3 min,此為測(cè)試階段。“探索”定義為小鼠的鼻觸碰到物體或者鼻與物體的距離＜2 cm,人工計(jì)數(shù)小鼠主動(dòng)探索每個(gè)目標(biāo)物的時(shí)間。在學(xué)習(xí)階段未探索目標(biāo)物、在測(cè)試階段只探索一個(gè)目標(biāo)物或者在兩個(gè)階段中總探索時(shí)間小于2 s 的小鼠因先天探索能力缺乏而被剔除。觀察指標(biāo)為在學(xué)習(xí)階段探索兩個(gè)相同紋理目標(biāo)物(a 和b)的總時(shí)間及在測(cè)試階段探索熟悉紋理(c)與新紋理(d)時(shí)間的百分比。測(cè)試條件及處理同1.2.1。

1.2.4 尼氏染色

小鼠予腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)深度麻醉后,用30 mL 4℃生理鹽水心臟灌流,斷頭取腦。將腦組織放入10%中性福爾馬林中固定,脫水后進(jìn)行石蠟包埋,制備3 μm 冠狀切片(前囟-0.94 ～-1.28 mm)。尼氏染色時(shí)將切片浸入裝有Cresyl violet Stain 試劑的染缸中,于機(jī)械對(duì)流烤箱56℃浸染1 h。然后用去離子水沖洗數(shù)次,隨后置于Nissl Differentiation 液中分化數(shù)秒至2 min(背景接近于無(wú)色)。最后無(wú)水乙醇迅速脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各取3 只小鼠的腦組織標(biāo)本,從每個(gè)標(biāo)本中隨機(jī)選取≥3 張不同切面的切片于40 × 鏡下觀察,選取≥3 個(gè)不重疊視野計(jì)數(shù)桶狀皮層II/III 層每個(gè)視野下的神經(jīng)元數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤差(±)表示,采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究統(tǒng)計(jì)方法均選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)軌跡及熱圖的代表圖如圖1A 所示。野生型小鼠和p53 基因敲除小鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域活動(dòng)的時(shí)間分別為(67.51 ± 6.92)s 和(57.42 ± 8.50)s,無(wú)顯著差異(P=0.360)(圖1B);總運(yùn)動(dòng)路程分別為(3914.52 ± 401.64) cm 和(4637.91 ± 323.37)cm,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.166)(圖1C),表明p53 基因缺失對(duì)小鼠的焦慮樣行為和自發(fā)活動(dòng)無(wú)顯著影響。

2.2 Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠在Y 迷宮中的運(yùn)動(dòng)軌跡圖和熱圖的代表圖如圖2A 所示。野生型小鼠和p53 基因敲除小鼠在Y 迷宮中的自發(fā)交替率(野生型小鼠:53.33% ±3.03%,p53 基 因 敲 除: 48.25% ± 3.94%,P=0.320)(圖2B)和進(jìn)入臂的總次數(shù)(野生型小鼠:33± 4 次,p53 基因敲除(28 ± 4)次,P=0.379)(圖2C)均無(wú)顯著差異,表明敲除p53 基因不影響小鼠的工作記憶能力。

2.3 紋理辨別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

紋理辨別實(shí)驗(yàn)操作示意圖如圖3A 所示。測(cè)試當(dāng)天,在學(xué)習(xí)和測(cè)試階段,兩種小鼠對(duì)相同紋理目標(biāo)物(野生型小鼠(21 ± 5)s,p53 基因敲除(22 ± 7)s,P=0.892)和不同紋理目標(biāo)物(野生型小鼠(19 ± 4)s,p53 基因敲除(14 ± 2)s,P=0.383)的總探索時(shí)間均相似(圖3B),但p53 基因敲除小鼠對(duì)新紋理目標(biāo)物探索時(shí)間與總探索時(shí)間的百分比較野生型小鼠更低(野生型小鼠: 59.98% ± 3.76%,p53 基因敲除:41.56% ± 3.55%,P=0.005)(圖3C),說(shuō)明敲除p53 基因可損傷小鼠對(duì)新紋理的辨別能力,即觸須敏感性降低。

2.4 尼氏染色結(jié)果

尼式染色代表圖如圖4A 所示。p53 基因敲除小鼠桶狀皮層第II/III 層神經(jīng)元數(shù)目較野生型小鼠顯著減少(野生型小鼠(68 ± 1)個(gè),p53 基因敲除(61 ± 1)個(gè),P=0.002)(圖4B),說(shuō)明敲除p53 基因可影響神經(jīng)元的生長(zhǎng)。

圖1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果(±s)Note. A. Representative tracks and heat maps of mice movements in the open field test. B. Histogram indicating the center time calculated from the open field test. C. Histogram indicating the total distance moved in the open field test.Figure 1 The results of the open field test(±s)

圖2 Y 迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果(±s)Note. A. Representative tracks and heat maps of mice movements in the Y-maze test. B. Histogram indicating the percentage of spontaneous alternation in the Y-maze test. C. Histogram indicating the number of arms entries in the Y-maze test.Figure 2 The results of the Y-maze test(±s)

圖3 紋理辨別實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果(±s)Note. A. Histogram indicating the total time spend to investigate the textures object. B. Histogram indicating the percentage of time to investigate the novel textures in the texture discrimination task. Compared with the WT mice, ??P＜0.01. (The same in the following figure)Figure 3 The results of the texture discrimination task(±s)

圖4 尼氏染色結(jié)果(±s)Note. A. Representative photomicrographs of the barrel cortex sections (Nissl staining), white squares represent the areas for analysis. B. Histogram indicating the number of neurons in the layers II/III of the barrel cortex.Figure 4 The results of the Nissl staining(±s)

3 討論

在神經(jīng)系統(tǒng)中,p53 基因廣泛分布于海馬、丘腦和小腦等部位[14],它不僅可通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元分化相關(guān)基因如GAP-43[15]和Map2[16]等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)影響神經(jīng)元分化和軸突再生,從而在神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育中發(fā)揮重要的功能;還參與調(diào)控神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因[17],在癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡[18]和腦缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞的自噬及凋亡[19]等病理情況下也具有重要的作用。

焦慮癥是一種常見(jiàn)的精神疾病,是當(dāng)面對(duì)威脅或壓力時(shí)產(chǎn)生的持續(xù)存在的恐懼感。評(píng)估小鼠的焦慮樣行為的常用方法有高架十字迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等,兩者對(duì)焦慮應(yīng)變差異的檢測(cè)與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)敏感性相當(dāng),通?？梢韵嗷ヲ?yàn)證。Amson 等[9]在圓形曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除小鼠具有焦慮樣行為,而Campana 等[10]在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果與此相反。相比于圓形曠場(chǎng),方形曠場(chǎng)更常用于嚙齒類動(dòng)物焦慮樣行為的評(píng)估[11]。本研究中方形曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p53 基因敲除小鼠無(wú)焦慮樣行為,與Campana 等[10]觀點(diǎn)一致。研究表明,開(kāi)闊曠場(chǎng)的形狀、大小、材質(zhì)、實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)長(zhǎng)、數(shù)據(jù)采集方式(攝像系統(tǒng)或紅外系統(tǒng))和測(cè)試時(shí)的光強(qiáng)等均可能對(duì)測(cè)試結(jié)果有一定的影響[20]。因此,上述結(jié)果不同可能與實(shí)驗(yàn)裝置、照明條件、實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)、數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)均不同有關(guān)。此外,王維剛等[21]研究認(rèn)為,相較于其他行為學(xué)實(shí)驗(yàn),如強(qiáng)迫游泳、水迷宮實(shí)驗(yàn)等,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的影響較小,因此在同一批小鼠進(jìn)行不同行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí),通常應(yīng)先進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。Amson 等[9]在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)也可能是導(dǎo)致其測(cè)試結(jié)果不同的原因。此外,Campana 等[10]通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、加速旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試觀察到p53 基因敲除小鼠基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)能力正常且無(wú)共濟(jì)失調(diào),但它們存在行走同步缺陷,可能與p53 基因缺失導(dǎo)致小腦發(fā)育異常有關(guān)。與Campana 等[10]一致,我們的結(jié)果表明p53 基因敲除小鼠活動(dòng)能力正常,排除了因小鼠活動(dòng)能力異常導(dǎo)致焦慮樣行為測(cè)試結(jié)果陰性的可能。

學(xué)習(xí)記憶力受損是認(rèn)知功能障礙中較為常見(jiàn)的一種表現(xiàn),Morris 水迷宮和Y 迷宮是目前最常用的評(píng)估方法之一。前者側(cè)重于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力,后者則主要觀察動(dòng)物的注意力、短時(shí)記憶和對(duì)信息的處理等工作記憶能力。研究發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)記憶能力受損[9],可能由于p53 基因缺失后機(jī)體抗凋亡能力下降,從而導(dǎo)致p53 基因敲除小鼠神經(jīng)細(xì)胞減少和大腦發(fā)育異常。Morris 水迷宮對(duì)工作記憶的測(cè)試不如Y 迷宮敏感[22],本研究中,p53 基因敲除小鼠在Y 迷宮中的自發(fā)交替率和進(jìn)入臂的總次數(shù)與野生型小鼠無(wú)差異,表明其工作記憶能力未受損。

嚙齒類動(dòng)物的觸須是一種非常發(fā)達(dá)的感覺(jué)器官,觸須的感覺(jué)輸入與覓食、探索、感知危險(xiǎn)等日常活動(dòng)息息相關(guān)。學(xué)者們通常通過(guò)刺激小鼠觸須或剪除觸須從而剝奪其觸須感覺(jué)輸入,進(jìn)而觀察其中樞投射部位—大腦軀體感覺(jué)皮層桶狀區(qū)域(barrel field of the somatosensory cortex,S1BF)神經(jīng)元的可塑性,這是一種常用于感覺(jué)經(jīng)驗(yàn)以及學(xué)習(xí)與記憶等任務(wù)研究的范式。桶狀皮層(barrel cortex)是S1BF 中的一個(gè)特殊區(qū)域,約占體感皮層的20%,共分為六層,其Ⅳ層可見(jiàn)“barrel”的桶狀結(jié)構(gòu),每個(gè)“barrel”與嚙齒類動(dòng)物的面部觸須具有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)觸須識(shí)別的信號(hào)到達(dá)桶狀皮層Ⅳ層神經(jīng)元后進(jìn)一步向上投射至II/III 層,該區(qū)域也是小鼠紋理識(shí)別任務(wù)主要的研究部位[23-25]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除小鼠對(duì)新紋理辨別能力減弱,即觸須敏感性受損,并除外了先天探索缺陷、自身焦慮、工作記憶障礙及自發(fā)運(yùn)動(dòng)對(duì)其的影響。為進(jìn)一步探究其機(jī)制,我們對(duì)p53 基因敲除小鼠大腦桶狀皮層II/III 層神經(jīng)元進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示p53 基因敲除小鼠該區(qū)域神經(jīng)元數(shù)目較野生型小鼠顯著減少。由于腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其下游的GAP-43 因子對(duì)桶狀皮層神經(jīng)元生長(zhǎng)至關(guān)重要[26],p53 基因缺失導(dǎo)致GAP-43 表達(dá)下調(diào)[7,15]可能是神經(jīng)元數(shù)目減少的原因之一,進(jìn)一步研究該信號(hào)通路對(duì)明確p53 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用具有重要的意義。

綜上所述,本研究觀察了p53 基因敲除小鼠的情緒、認(rèn)知、感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)方面的神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果,并初步探討了其細(xì)胞機(jī)制。我們的結(jié)果首次揭示了p53 基因缺失可導(dǎo)致小鼠觸覺(jué)行為異常,并初步分析這種異常與桶狀皮層II/III 層神經(jīng)元數(shù)目減少有關(guān),為后期進(jìn)一步探討這一內(nèi)在機(jī)制及p53 基因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)的作用提供了理論基礎(chǔ)。