李聰高澤林方碧青史仍飛

(上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

肌少癥(sarcopenia)主要是指隨著年齡的增長,出現(xiàn)全身性骨骼肌質(zhì)量的丟失和力量的降低,其本質(zhì)是骨骼肌在衰老進(jìn)程中表現(xiàn)為“蛋白質(zhì)合成抵抗”等問題。隨著社會老齡化進(jìn)程的加劇,肌少癥已成為影響老年人健康的突出問題,且探討肌少癥發(fā)生機(jī)制及防治的研究也是目前研究熱點。選擇和建立肌少癥動物模型是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ),本文通過檢索近幾年肌少癥建模方面的文獻(xiàn),梳理各自優(yōu)缺點及評價標(biāo)準(zhǔn),以期為進(jìn)行相關(guān)的實驗研究提供參考。

1 肌肉減少綜合癥

1.1 肌肉減少綜合癥的定義

“肌肉減少綜合癥”是Rosenberg[1]于1989年首次提出的概念,簡稱肌少癥(sarcopenia)。肌肉減少綜合癥用來描述老年人隨著年齡增長,自身肌肉質(zhì)量與肌肉力量相應(yīng)減弱,從而引起全身的活動能力下降,導(dǎo)致跌倒、骨折甚至殘疾的風(fēng)險增加。2010年,歐洲老年人肌少癥工作組(EWGSOP)將其定義為:“一種以進(jìn)行性骨骼肌肌量和強(qiáng)度廣泛損失引起的肢體功能障礙、生活質(zhì)量下降和死亡等不良事件風(fēng)險增加的綜合癥”[2]。除了歐洲老年人肌少癥工作組(EWGSOP) 以外, 國際肌少癥工作組(IWGS)及亞洲肌少癥工作組(AWGS)均給出了各自的定義,基本上其臨床表現(xiàn)主要在兩個方面:骨骼肌質(zhì)量的下降和骨骼肌肌力的減弱。2016年中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會發(fā)布了中國的《肌少癥共識》[3]。

1.2 肌少癥的研究現(xiàn)狀

肌肉減少綜合癥嚴(yán)重影響老年人的身體功能,研究顯示老年肌少癥患者跌倒風(fēng)險增加可能與肌肉纖維數(shù)量及運動神經(jīng)元數(shù)量的減少有關(guān),這些生理變化會對機(jī)體功能產(chǎn)生不良影響,導(dǎo)致老年人平衡能力減弱、步速減緩、身體搖擺增加[4]。另外,肌肉減少綜合癥不僅損害老年人的身體功能,也會對其心理健康狀況造成不良影響,導(dǎo)致老年人心理負(fù)擔(dān)加重,最終嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。

目前,人口老齡化趨勢增加已成為全球性關(guān)注的健康問題。在中國,人口老齡化狀況越來越嚴(yán)重,根據(jù)“第六次全國人口普查”的數(shù)據(jù)顯示,2010年底我國60 歲以上老年人口的比例為13.3%[5],表明我國已進(jìn)入老年化社會,而且老年人口比例還在進(jìn)一步升高。開展人口老齡化相關(guān)的研究也成為重中之重。

1.3 動物肌少癥模型構(gòu)建對于肌肉減少綜合癥研究的意義

雖然國際上對肌少癥的研究熱度越來越高,但目前還沒有明確的肌肉減少綜合癥治療方案,對于肌少癥的研究仍需拓展加深。選擇適宜的動物模型對研究肌少癥尤為重要。由于研究老齡化的復(fù)雜性及實驗干預(yù)的不確定性等問題,目前主要關(guān)注動物建模的評定指標(biāo)、建模方式、優(yōu)缺點和目的等。本文將以大鼠和小鼠為實驗對象,介紹肌少癥建模的方案及特點,為進(jìn)行相關(guān)的研究提供參考。

2 肌少癥的評定指標(biāo)及評定方式

肌少癥主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量下降、骨骼肌肌力減弱為主要臨床特征。這也是建立肌少癥動物模型的依據(jù)。

對大鼠和小鼠肌肉質(zhì)量的檢測主要通過稱重和儀器檢測的方式來進(jìn)行,活體可以采用的儀器檢測包括:生物電阻抗測量(BIA)、核磁共振技術(shù)(MRI)、計算機(jī)X 線體層攝影(CT)和雙能X 線吸收測量(DXA)[6]。而對大鼠和小鼠肌肉力量和功能的檢測常使用抓力儀和轉(zhuǎn)棒式疲勞儀來檢測[7]。

3 肌肉減少綜合癥模型

肌少癥建模目前常采用大鼠、小鼠作為建模對象,常用的方法主要有試劑注射法、物理法、選材法和手術(shù)法等。

3.1 地塞米松注射法

藥物注射法是動物建模的常用方法,在肌少癥模型中常采用地塞米松(dexamethasone,DXM)藥物注射。DXM 屬于糖皮質(zhì)激素,具有抗炎、抗過敏和抗休克的功效,但長期注射會有體重增加、肌肉萎縮、脂肪向心性堆積等副作用[8]。基于此方面的作用,在一些實驗研究中,對小鼠注射DXM,被用作小鼠肌少癥建模的方案。我國學(xué)者魯飛翔等[9]采用6 ～7月齡C57BL/6 小鼠,進(jìn)行6周皮下注射DXM,注射劑量為5 mg/kg 體重,發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉質(zhì)量和功能均顯著降低,認(rèn)為造模成功。同時,在王月兵等[10]人的研究中也出現(xiàn)類似的結(jié)果,此項實驗中分別對8 ～10周齡小鼠和6 ～7 月齡小鼠使用DXM試劑注射干預(yù)19 d,注射劑量為5 mg/kg 體重。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 ～10周齡實驗組小鼠與對照組相比,肌肉質(zhì)量降低了14.33%(P＜0.01);6 ～7 月齡實驗組小鼠與對照組相比,肌肉質(zhì)量降低了6.06%(P＜0.05)。但需要注意的是6 ～7 月齡小鼠脂肪的增加高于8 ～10周齡小鼠,因此認(rèn)為在此實驗條件下6 ～7 月齡小鼠相較于8 ～10周齡小鼠更適合作為長期研究肌肉衰減綜合征模型。

國外學(xué)者Aru 等[11]人采用22 月齡的雌性Wistar 大鼠,進(jìn)行10 d 的皮下注射DXM,注射劑量為0.50 μg/g,造成大鼠體重和瘦體重均明顯下降,同時后肢抓力也下降了25%(P＜0.01),認(rèn)為造模成功。

以上研究表明,通過DXM 注射能夠造成肌肉質(zhì)量降低和肌肉功能減弱,達(dá)到與老年人肌少癥高度相似的特征,認(rèn)為采用成年大小鼠,進(jìn)行DXM 注射建立肌少癥模型是可行的,但是最佳的DXM 注射劑量和注射周期還有待進(jìn)一步研究,以及潛在的副作用尚不清楚。

3.2 肉毒毒素A(botulinum toxin)注射法

神經(jīng)退行性病變被認(rèn)為是引起肌少癥的發(fā)病機(jī)制之一。肉毒毒素A(botulinum toxin,BTX)是一種高分子蛋白毒素,能抑制運動神經(jīng)元乙酰膽堿釋放到神經(jīng)肌肉連接處的突觸間隙,使肌肉麻痹,從而導(dǎo)致肌肉的快速丟失[12],也被應(yīng)用于建立肌少癥模型。Brent 等[13]的研究中,對成年雌性Wistar 大鼠(12 ～14周齡)進(jìn)行BTX 注射6周(2IU),能顯著造成肌肉質(zhì)量和肌肉橫截面積降低,成功建立肌少癥動物模型。但需要注意的是,BTX 在造成肌肉流失的同時,往往伴隨骨質(zhì)流失,這與單獨的老年人肌少癥有一定的差異,所以針對此方法的可行性還需進(jìn)一步研究探討。

3.3 后肢懸吊(hind limb suspension)法

小鼠后肢懸吊法(hind limb suspension,HLS)是常用的肌少癥造模方法[14]。通常采用動物后肢懸吊裝置(見圖1)模擬微重力條件造成廢用性肌肉模型[15]。Morey 等[16]采用后肢懸吊裝置對大鼠進(jìn)行HLS 一定時間,大鼠的肌肉會出現(xiàn)廢用性萎縮,肌肉質(zhì)量和肌肉力量均會降低。同時,荊小馬等[17]對老齡小鼠(26 月齡)進(jìn)行HLS2周后,導(dǎo)致小鼠腓腸肌質(zhì)量顯著降低,證實HLS 會誘發(fā)小鼠肌肉的萎縮。

圖1 嚙齒類動物后肢懸吊示意圖Note. A. Rodent hind limb suspension device. B. Rodent suspension method. F1、F2. Vertical tension. F3. Forelimb support. F4. Diagonal pull.Figure 1 Schematic diagram of rodent hind limb suspension

除此以外,Goldspink 等[18]的研究還發(fā)現(xiàn),使用小鼠HLS 的方式建立小鼠肌少癥模型,小鼠的I 型慢速肌纖維的減少比II 型快速肌纖維的減少更明顯,這種微重力狀況下導(dǎo)致的肌肉丟失與老年人肌少癥的癥狀:II 型肌纖維的減少多于I 型肌纖維的減少不太相似。

通常,在康復(fù)醫(yī)療和航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中可能會使用此方式建模,從建模的機(jī)制上探討,運用此方法建模的優(yōu)點是無需藥物干預(yù),對后續(xù)實驗差異的影響較小。不過,最大的局限在于運用此方式建模小鼠肌肉衰減所表現(xiàn)出的特征與老年人不相符。

3.4 關(guān)節(jié)位置固定法

關(guān)節(jié)位置固定法主要造成被固定的肌肉失去收縮舒張等活動,從而引起肌肉萎縮(圖2),此方法常被用作模擬骨折后的石膏、繃帶或螺旋線進(jìn)行包裹固定,從而限制大鼠的關(guān)節(jié)活動,在限制大鼠關(guān)節(jié)活動一段時間后,可能會造成大鼠肌肉的廢用性萎縮,導(dǎo)致大鼠肌肉質(zhì)量和肌肉力量的降低,從而建立大鼠肌少癥模型。Ohira 等[19]的研究中對成年Wistar 大鼠進(jìn)行后肢固定,經(jīng)過10 d 的固定就成功造成比目魚肌出現(xiàn)廢用性萎縮,且I 型慢速肌纖維的減少量大于II 型快速肌纖維。

雖然關(guān)節(jié)位置固定也是一種無需藥物干預(yù),簡便且易于操作的建模方法,但是局限性也在于運用此方法建模,其肌肉衰減所表現(xiàn)出的癥狀與老年人不相符。不僅如此,目前關(guān)于使用關(guān)節(jié)位置固定法進(jìn)行大鼠肌少癥建模的研究仍較少,其固定方式和固定干預(yù)時間仍需進(jìn)一步研究探討。

3.5 直接選材法

雖然注射法、物理法等方法可以導(dǎo)致大鼠和小鼠的肌肉質(zhì)量和肌肉力量降低,但與老年人肌少癥的表現(xiàn)癥狀仍有差別,因此直接選取老年大鼠建立肌少癥模型有一定的優(yōu)勢。在Kob 等[20]的實驗中,直接選取6 月齡的大鼠并進(jìn)行高脂飲食飼養(yǎng),在第16 月時通過檢測發(fā)現(xiàn)雄性大鼠的肌肉橫截面積減少,認(rèn)為造模成功。不過需要注意的是,在此實驗中雌性大鼠的肌肉量并沒有明顯減少。

圖2 嚙齒類動物后肢關(guān)節(jié)固定法Figure 2 Rodent hind limb joint fixation

雖然直接選取老齡肌肉衰減大鼠的“天然模型”有其自身的優(yōu)勢,但較高的經(jīng)濟(jì)成本和時間成本投入讓直接采取這種方法建立肌少癥模型顯得有些困難,同時選材法可能還存在大鼠的性別差異。

3.6 加速衰老模型

為了進(jìn)一步研究肌肉減少綜合癥,一些加速衰老的小鼠已被開發(fā)。這類小鼠會快速衰老,方便觀察其肌肉生理變化和解剖形態(tài)。研究顯示,SAMP6[21]和SAMP8[22]是建立小鼠骨骼肌衰老的理想模型。Derave 等[23]研究發(fā)現(xiàn)相比于SAMR1 抗衰老模型小鼠,加速衰老的SAMP6 和SAMP8 兩種小鼠均隨著年齡增長出現(xiàn)肌肉力量、肌纖維尺寸以及肌肉磷酸肌酸水平的下降。與此同時,SAMP8 小鼠相較于SAMP6 小鼠其肌肉量和肌肉力量下降速度更快,開始出現(xiàn)下降的時間也更早。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行推斷,使用SAMP8 小鼠可能是建立肌少癥的理想模型。

另一種能夠建立小鼠肌少癥模型的加速衰老小鼠是POLG 小鼠,POLG 對線粒體DNA 的復(fù)制和修復(fù)起到十分重要的作用,POLG 缺失將導(dǎo)致線粒體功能的紊亂[24]。這種加速衰老模型的小鼠在6月齡后即表現(xiàn)出肌肉流失,可能也是小鼠肌少癥建模的一種理想選材。

3.7 轉(zhuǎn)基因小鼠

轉(zhuǎn)基因小鼠也被開發(fā)用于肌少癥建模。MKR小鼠是一種骨骼肌中IGF-1 受體表達(dá)轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)基因小鼠,IGF-1 受體的缺失可能會影響小鼠的肌肉發(fā)育生長[25]。Mavalli 等[26]發(fā)現(xiàn),IGF-1 受體缺失的小鼠在6周齡和16周齡時相比野生型小鼠,其肌纖維橫截面積均明顯減少。

除了IGF-1 受體缺失的小鼠可用于小鼠肌少癥建模,Akt1/Akt2 雙敲除的小鼠也表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長缺陷及骨骼肌萎縮,與IGF-1 受體缺失小鼠類似[27]。需要注意的是,盡管這兩種類型的小鼠都表現(xiàn)出肌肉萎縮,但Akt 雙敲除的小鼠主要表現(xiàn)為肌細(xì)胞尺寸減少,而IGF-1 缺失的小鼠則表現(xiàn)為肌細(xì)胞數(shù)量的減少。

3.8 雌性大鼠去除卵巢建模法

雌激素在骨質(zhì)疏松中起著重要的調(diào)節(jié)作用,雌激素缺乏將引起骨質(zhì)疏松癥[28]。而當(dāng)骨質(zhì)疏松(osteoporosis)發(fā)生后,骨骼肌的代謝水平也會隨之發(fā)生變化,并出現(xiàn)肌肉質(zhì)量和功能的減退[29]。這一特征與肌少癥的癥狀高度相似,運用雌激素的這一機(jī)制, 可以嘗試通過大鼠卵巢去除手術(shù)(ovariectomy,OVX)進(jìn)行肌少癥建模。

在Nakaoka 等[30]的實驗中,對24 只12周齡的Sprague-Dawley 大鼠進(jìn)行OVX 實驗,7 d 后經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)雌性大鼠的骨骼肌質(zhì)量明顯降低。另外,尹博[31]對28 只三月齡SD 雌性大鼠進(jìn)行OVX,一周后進(jìn)行測量,發(fā)現(xiàn)手術(shù)后的雌性大鼠腓腸肌質(zhì)量和抓力均明顯下降,認(rèn)為造模成功。

運用雌性大鼠去除卵巢的方式建模其特征與老年人肌少癥的癥狀高度相似,美中不足是過程繁瑣以及對手術(shù)技術(shù)要求較高。

4 小結(jié)

鑒于肌少癥是影響老年人群健康和生活質(zhì)量的重要因素,進(jìn)行相關(guān)的研究也是目前的研究熱點。選擇及建立肌少癥動物模型是開展相關(guān)研究的保障,目前肌少癥模型方案主要有試劑注射法、物理法、選材法、手術(shù)法和基因敲除等方法,但關(guān)于模型之間的對比研究每種方法各有其優(yōu)缺點,需要根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇。但缺乏各肌少癥模型之間的對比研究,以及模擬人體衰老中骨骼肌丟失的理想模型還有待于探索。