劉 瀅，黃 宙

（1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南湘潭 411102；2.湘潭市中心醫(yī)院，湖南湘潭 411100）

竹節(jié)參為五加科植物，性溫、味甘、味苦，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、散瘀止痛及止血祛痰功效［1-4］，廣泛用于產(chǎn)后虛弱、咳嗽痰多及跌打損傷患者中［5］?，F(xiàn)代藥理結(jié)果表明［6］，竹節(jié)參具有抗炎、延緩衰老、降血糖及抗腫瘤作用。皂苷是竹節(jié)參的主要活性成分（約占23.6%），且三萜類皂苷具有較高含量，具有解熱、抗菌、抗癌等生物作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明［7］，天然藥物具有較低的毒副作用，臨床使用時(shí)不宜產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)實(shí)體瘤具有良好的療效，但是在宮頸癌中的作用機(jī)制研究相對(duì)較少。因此，本研究以宮頸癌Hela 細(xì)胞作為對(duì)象，探討竹節(jié)參水提物在宮頸癌Hela細(xì)胞中的作用機(jī)制及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，以期為宮頸癌治療提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞 宮頸癌Hela 細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，將其接種在含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基中，在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)者，備用。

1.2 藥材 竹節(jié)參產(chǎn)地湖北恩施，購于恩施竹節(jié)參種植基地，經(jīng)專家鑒定為正品。將藥材根莖干燥粉碎后純凈水回流提取3 次，濾液濃縮，即得提取物，提取率為25.8%，加入 DMEM 培養(yǎng)基依次制成 0（陰性對(duì)照）、50、100、150 μg／mL。

1.3 儀器 見表1。

表1 儀器信息

2 方法

2.1 細(xì)胞處理 取第3 代培養(yǎng)的宮頸癌Hela 細(xì)胞，0.25%EDTA 進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中至單層細(xì)胞。將0（陰性對(duì)照）、50、100、150 μg／mL 竹節(jié)參提取物分別加入宮頸癌Hela 細(xì)胞中（100 μL／孔），每種質(zhì)量濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，連續(xù)進(jìn)行48 h 培養(yǎng)［8］。

2.2 細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用一步法TUNEL 染色測(cè)定。取各組處理后的細(xì)胞，加入0.25% EDTA-胰蛋白酶完成細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105／mL，接種在96 孔板中，每孔200 μL，放入培養(yǎng)箱中48 h。在12、24、36、48 h 后向細(xì)胞中滴加TUNEL 檢測(cè)液（含TdT 酶2 μL、熒光標(biāo)記液48 μL），避光孵育，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞情況，并且在波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射光540 nm 處測(cè)定OD值，每張圖片取5 個(gè)視野，在400 倍下完成凋亡細(xì)胞核計(jì)數(shù)，獲得凋亡率［9］。

2.3 細(xì)胞周期測(cè)定 采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定。取生長(zhǎng)良好的宮頸癌Hela 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，接種在6 孔培養(yǎng)板中，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后換入新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)48 h 后加入不含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化懸浮，4 ℃下收集細(xì)胞。采用預(yù)冷的PBS 緩沖液（pH 值為7.4）對(duì)細(xì)胞沖洗2 次，加入-20 ℃預(yù)冷的乙醇3 mL，吹打均勻后放置在-20 ℃冰箱中固定24 h。測(cè)定前對(duì)各組細(xì)胞離心10 min（1 424×g），PBS 緩沖液沖洗2次，去除上層清液后重懸于200 μL 0.1 mmol／L EDTA 溶液中，30 min 避光孵育后加入35 μL 2% Tritonx-100、114 μL 150 μg／mL PI 溶液，充分混合后避光反應(yīng)10 min，將最終獲得的混合液于EPICS XL 型流式細(xì)胞儀中完成細(xì)胞周期測(cè)定［10］。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 采用Hoechst 33342 熒光染色觀察。取不同質(zhì)量濃度竹節(jié)參水提物處理后的細(xì)胞，離心10 min后去除上層清液，加入10 g／L Hoechst 33342 熒光染色液，避光染色10 min 后去除染液，PBS 洗滌2 次后涂片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察，波長(zhǎng)為340 nm，保存結(jié)果［11］。

2.5 凋亡相關(guān)基因測(cè)定

2.5.1 RNA 提取 向各組處理后的細(xì)胞中加入500 μL trizol，混合、均勻后加入氯仿0.2 mL，劇烈振蕩15 s，常溫下靜置2～3 min 后離心15 min（12 000 r／min），獲得3層液體（上層為水相，中間層與下層為有機(jī)相）。取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP 管中，加入0.5 mL 異丙醇，混合后放在-20 ℃冰箱中，10 min 離心（1 194×g），獲得凝膠狀沉淀（即為RNA）。充分洗滌RNA，加入250 μL DEPC、750 μL 乙醇，乙醇沖洗沉淀，離心5 min（2 315×g），取沉淀放入工作臺(tái)上干燥20 min。利用紫外分光度儀檢測(cè)RNA 濃度，并完成RNA 提純（以核糖核酸酶作為空白對(duì)照），在260 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。采用脫氧核糖核酸酶處理RNA 后，放入冰箱中［12］。

2.5.2 PCR 檢測(cè) 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法測(cè)定P53、Bax、Casepase-3 mRNA 表達(dá)水平，引物序列見表2。設(shè)定PCR 反應(yīng)條件為30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下完成10 min 延長(zhǎng)。擴(kuò)增產(chǎn)物放入1.5%瓊脂凝膠中電泳，完畢后采用UVP 凝膠圖像完成灰度值的測(cè)定，以β-actin為內(nèi)參［13］。

表2 引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS18.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈濃度、時(shí)間依賴性，36 h 后可達(dá)50.0%以上，見表3。

3.2 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞周期的影響 竹節(jié)參水提取物主要作用于宮頸癌Hela 細(xì)胞G0／G1期與S期，隨著其劑量升高逐漸集中于G0／G1期，見表4。

3.3 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞形態(tài)的影響 Hoechst 33342 熒光染色顯示，0 μg／mL 竹節(jié)參水提物下Hela細(xì)胞形態(tài)均一，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整；在50、100、150 μg／mL下，Hela 細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞形態(tài)固縮，可見凋亡小體，并且劑量越高，細(xì)胞凋亡越明顯，見圖1。

表3 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用（%，， n＝4）

表3 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用（%，， n＝4）

注：與0 μg／mL 比較，?P＜0. 05；與12 h 比較，#P＜0.05。

表4 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞周期的影響（%，， n＝4）

表4 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞周期的影響（%，， n＝4）

注：與0 μg／mL 比較，?P＜0.05。

圖1 不同劑量竹節(jié)參水提取物下宮頸癌Hela 細(xì)胞形態(tài)

3.4 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響 竹節(jié)參水提取物可增加宮頸癌Hela 細(xì)胞中P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)，并呈濃度依賴性，見表5、圖2。

表5 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響（， n＝4）

表5 竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響（， n＝4）

注：與0 μg／mL 比較，?P＜0.05。

4 討論

圖2 不同劑量竹節(jié)參水提取物下宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡基因表達(dá)

宮頸癌是女性發(fā)生率較高的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、治愈率低、致死率高等特點(diǎn)［14］。目前，化療、手術(shù)與放療占據(jù)宮頸癌治療的主要地位，但是無論何種方法均存在明顯的局限性，且治療均無法做到徹底、副作用較大，患者治療后復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期生存率較低［15］。竹節(jié)參是臨床上常用的中藥，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、散瘀止痛、止血祛痰等作用［16］。體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［17］，竹節(jié)參水提物對(duì)于肝癌、鼻咽癌、肺癌及胃癌等實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤作用，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，竹節(jié)參水提物能抑制血管的形成，有助于增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。有研究表明［18］：竹節(jié)參具有抗炎及潛在的抗腫瘤作用，其水提物能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫水平，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，本研究基于當(dāng)前研究，分析了竹節(jié)參水提物對(duì)于宮頸癌HeLa 細(xì)胞的作用機(jī)制，結(jié)果表明：竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞的凋亡率隨著竹節(jié)參水提取物濃度、作用時(shí)間的延長(zhǎng)增加，36 h時(shí)竹節(jié)參水提取物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖抑制基本達(dá)到50.0%以上；竹節(jié)參水提取物作用于宮頸癌Hela 細(xì)胞G0／G1期與S 期；隨著竹節(jié)參水提取物濃度升高，竹節(jié)參水提取物對(duì)于宮頸癌Hela 細(xì)胞作用集中于G0／G1期，說明竹節(jié)參水提物能抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，藥物多作用于細(xì)胞生長(zhǎng)初期，且藥物濃度越高，作用效果越明顯。

細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，其過程不是被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)的過程，多涉及基因的激活、表達(dá)與調(diào)控作用，是為了更好的適應(yīng)生存而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程［19］。但是，對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言其生長(zhǎng)無限增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡紊亂，會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生明顯的不適，嚴(yán)重者可危及生命。P53 基因?qū)儆谌梭w抑癌基因，含有大量的脯氨酸，其失活對(duì)腫瘤的形成具有重要的意義。臨床研究表明［20］，P53 基因是相對(duì)重要的抗癌基因，其野生型能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，防止癌變的發(fā)生，亦可輔助細(xì)胞基因修復(fù)。但是，P53基因發(fā)生突變后，則會(huì)增加癌變發(fā)生率。Bax 基因?qū)儆谕每谷藛慰寺】贵w，屬于Bcl-2 基因家族中細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因，其過度表達(dá)能拮抗Bcl-2 的保護(hù)效應(yīng)，能使得細(xì)胞趨于死亡。研究表明：Bax 基因是人體主要凋亡基因，可與Bcl-2 形成異二聚體，能抑制Bcl-2 的產(chǎn)生，是人體相對(duì)重要的促細(xì)胞凋亡基因之一。Caspase-3 在細(xì)胞凋亡中具有不可替代的作用，可以被多種因素活化，在CTL 細(xì)胞殺死中發(fā)揮重要作用。臨床研究表明：Caspase-3 與DNA 修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)等有關(guān)。本研究中，Hoechst 33342 熒光染色結(jié)果表明：竹節(jié)參水提物0 μg／mL 時(shí)HeLa 細(xì)胞形態(tài)均一且結(jié)構(gòu)相對(duì)完整；而竹節(jié)參水提取物 50、100、150 μg／mL下HeLa 細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞形態(tài)固縮，可見凋亡小體；竹節(jié)參水提取物能增加宮頸癌HeLa 細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)，且竹節(jié)參水提取物濃度越高，凋亡相關(guān)基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)越高，說明竹節(jié)參水提物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，能增加凋亡基因表達(dá)水平，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，竹節(jié)參水提物體外能抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖，能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬與凋亡，可能與調(diào)控凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)有關(guān)，具有潛在的抗癌作用。