李 瑩，張竹青，王連剛，袁宗英，于建壘，于 靜，張 霞，郭志青，許曼琳，宋新穎，何 康，遲玉成*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.萊西市望城街道辦事處農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，山東 萊西 266601；3.青島市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東 青島 266071； 4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

花生(Arachishypogaea)是我國(guó)重要的油料與經(jīng)濟(jì)作物，是食用植物油和蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，其在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和對(duì)外貿(mào)易中占據(jù)著不可或缺的地位。隨著氣候和種植模式的變化，花生病害逐年嚴(yán)重，儼然成為花生產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的主要障礙，也是導(dǎo)致花生供不應(yīng)求的重要原因。

花生根腐病是一種常發(fā)性病害，在生產(chǎn)上是最難以防治的土傳病害之一。鐮孢菌屬(Fusarium)真菌是一類既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌，是使農(nóng)作物致病的重要病原菌[1-2]。在花生的整個(gè)生育期均可以進(jìn)行侵染，播種后出苗前會(huì)導(dǎo)致芽和種子腐爛等現(xiàn)象；苗期感染會(huì)導(dǎo)致花生苗出現(xiàn)根腐、枯萎等情況；成株期通過(guò)破壞花生的維管束組織，影響花生進(jìn)行正常的水分和營(yíng)養(yǎng)等物質(zhì)運(yùn)輸，從而導(dǎo)致根腐、莖腐、莖基腐等嚴(yán)重病害[3-4]。鐮孢菌在感染花生后可在植株內(nèi)寄生很長(zhǎng)時(shí)間并且具有很強(qiáng)的隱蔽性。到發(fā)育后期，開始侵染花生莢果，導(dǎo)致花生品質(zhì)出現(xiàn)下降，更嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)籽粒腐爛并且產(chǎn)生有毒物質(zhì)，對(duì)花生產(chǎn)量及品質(zhì)產(chǎn)生極大影響，嚴(yán)重時(shí)造成減產(chǎn)20%以上[5]。由鐮孢菌引起其他作物根腐病的情況也不乏報(bào)道，如大豆根腐病[6]、豇豆根腐病[7]、百合根腐病[8]、黨參根腐病[9]及丹參根腐病[10]等。

對(duì)鐮孢菌生長(zhǎng)發(fā)育的研究將有助于了解其培養(yǎng)特性的差異，尋找培養(yǎng)過(guò)程的異質(zhì)性指標(biāo)，為進(jìn)一步研究鐮孢菌的致病機(jī)理提供相關(guān)依據(jù)[11]，同時(shí)，可以加快田間病害的病原菌鑒定。通過(guò)對(duì)鐮孢菌致病力的差異分析，可有效鑒定強(qiáng)致病力菌株，加以重點(diǎn)防治，減輕花生根腐病的發(fā)生，提高花生的產(chǎn)量及品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)和茄腐鐮孢菌(Fusa-riumsolani)是實(shí)驗(yàn)室采集分離自花生根腐病的病原菌，由實(shí)驗(yàn)室保存。供試品種花育36號(hào)。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試PDA、PDB培養(yǎng)基的配制參考方中達(dá)的方法[12]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鐮孢菌培養(yǎng)與觀察

① 固體培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察：在PDA培養(yǎng)基上選取生長(zhǎng)5 d的供試菌株，在菌落邊緣打取6 mm的菌餅，有菌絲的一面緊貼培養(yǎng)基，分別接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上。25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d。觀察并記錄鐮孢菌的顏色、氣生菌絲并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

② 液體培養(yǎng)及分生孢子計(jì)數(shù)：取直徑6 mm菌餅6個(gè)分別接到40 mL PDB液體培養(yǎng)基中，于25 ℃的搖床中150 r/min培養(yǎng)5 d，使用無(wú)菌過(guò)濾布進(jìn)行過(guò)濾，去除其中的菌絲和菌餅，得到孢子懸液。經(jīng)4 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入ddH2O重新懸浮，經(jīng)3次離心-懸浮，獲得干凈無(wú)雜質(zhì)的孢子懸浮液。在顯微鏡下觀察3種鐮孢菌分生孢子的產(chǎn)生過(guò)程，觀察孢子形態(tài)并統(tǒng)計(jì)三種鐮孢菌孢子的大小，n=100，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照上述方法獲得孢子懸浮液，稀釋100倍后在顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。每次試驗(yàn)每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 鐮孢菌接種

① 胚軸接種法：挑選大小一致，顆粒飽滿的花生種在蛭石中培育，放置于25 ℃黑暗條件下，種子萌發(fā)至胚軸生長(zhǎng)達(dá)5 cm左右時(shí)，每株花生胚軸上接種一個(gè)菌餅，每個(gè)鐮孢菌株至少接種6株，置于25 ℃條件下黑暗保濕培養(yǎng)5 d，每天觀察其發(fā)病情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

② 浸根接種法：在溫室中選取大小一致培養(yǎng)7 d的健康花生苗，每5株為一組，置于滅菌的罐頭瓶中，每個(gè)罐頭瓶中加入107個(gè)/mL濃度的孢子懸浮液200 mL，浸泡花生苗根部，置于25 ℃的搖床上80 r/min培育3 d，每日觀察并記錄花生的發(fā)病情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

③ 土壤接種法：按照上述方法獲得孢子懸液，調(diào)到濃度1×107個(gè)/mL。在一次性杯子的1/3底層用滅菌土，中間層用孢子液拌土，上層為滅菌土。將消毒處理后的花生種置于上層滅菌土中，每個(gè)一次性杯子種一?；ㄉN，每5株為一個(gè)鐮孢菌處理組，設(shè)3組鐮孢菌處理，1組對(duì)照(不加孢子液)，待植株發(fā)病較為明顯時(shí)拍照，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮孢菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖1可知，F(xiàn).oxysporum菌落呈圓形，產(chǎn)生很厚的白色氣生菌絲，菌絲致密，在生長(zhǎng)過(guò)程中邊緣較為不規(guī)則，菌絲背面橙紅色；F.proliferatum菌落呈圓形且中間部分出現(xiàn)氣生菌絲斷層，菌絲顏色由淡黃至灰白，菌落較為致密且邊緣不規(guī)則，菌絲背面中心呈紫紅色，外圍淡黃色；F.solani菌落呈圓形，氣生菌絲較薄且中間部分出現(xiàn)氣生菌絲斷層，菌落質(zhì)地內(nèi)圈較稀疏，外圈致密，邊緣規(guī)則，菌絲背面有明顯的菌絲圈，顏色由內(nèi)到外逐漸變淺。現(xiàn)將這三種鐮孢菌菌絲的形態(tài)特征歸納如表1。

表1 不同鐮孢菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) Table 1 Colony morphology of Fusarium on the PDA

2.2 產(chǎn)孢過(guò)程及孢子形態(tài)

為了解鐮孢菌的產(chǎn)孢過(guò)程，在顯微鏡視野中觀察到菌絲分枝的頂端縊縮產(chǎn)生小型分生孢子(圖2)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)F.oxysporum的小型分生孢子一般無(wú)隔、單細(xì)胞，孢子大小(3.97～4.66)μm×(2.88～3.62)μm，大型分生孢子鐮刀型，多數(shù)3隔，(12.51～43.68)μm×(2.92～5.05)μm；F.proliferatum的小型分生孢子1～2個(gè)隔，孢子大小(6.58～12.63)μm×(2.98～4.78)μm，大型分生孢子舟型，(22.36～45.83)μm×(3.58～5.02)；F.solani的小型分生孢子形態(tài)最大，小型分生孢子大小(8.84～15.60)μm×(2.97～4.94)μm，大型分生孢子鐮刀型，(18.51～44.67)μm×(3.18～6.23)μm。

2.3 產(chǎn)孢量

按照1.3.1 ② 的方法，對(duì)三種鐮孢菌進(jìn)行了產(chǎn)孢量的測(cè)定，如圖3所示，孢子含量分別為：(9.11±0.59)×107/mL、(6.68±0.77)×107/mL、(1.68±0.42)×107/mL；結(jié)果經(jīng)新復(fù)極方差分析，三種鐮孢菌的產(chǎn)孢能力存在極顯著性差異(P<0.01)，且尖孢鐮孢(A)>層出鐮孢(B)>茄腐鐮孢(C)。

2.4 鐮孢菌侵染花生的致病力測(cè)定

2.4.1 菌絲塊接種花生胚軸法測(cè)定鐮孢菌致病力

圖4所示，菌絲塊接種的花生胚軸上長(zhǎng)出白色的菌絲，胚軸變褐且發(fā)病范圍分別為F.oxysporum2.3±0.3 cm、F.proliferatum2.0±0.2 cm、F.solani1.1±0.2 cm。經(jīng)測(cè)量統(tǒng)計(jì)發(fā)病長(zhǎng)度并新復(fù)極方差分析，結(jié)果表明，三種鐮孢菌的菌絲塊在花生胚軸上的致病力呈現(xiàn)顯著差異(P<0.01)：尖孢鐮孢(A)>層出鐮孢(AB)>茄腐鐮孢(B)。

2.4.2 孢子液浸根法測(cè)定鐮孢菌致病力

如圖5所示，F(xiàn).oxysporum接種的花生苗側(cè)根脫落，脫落的側(cè)根呈腐爛狀，主根顏色變成褐色；F.proliferatum接種后的花生側(cè)根脫落，脫落的側(cè)根顏色變褐，但未腐爛，主根顏色變成輕微褐色；花生苗接種F.solani后側(cè)根脫落，脫落的側(cè)根顏色變褐，但未腐爛，主根顏色輕微褐色，與F.proliferatum接種的變化差異不明顯。對(duì)照組花生苗側(cè)根完整無(wú)脫落，顏色正常。

2.4.3 孢子液拌土培育花生苗法測(cè)定鐮孢菌致病力

在前述離體接種分析致病力的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析活體上接種以確認(rèn)是否會(huì)呈現(xiàn)相似的致病力結(jié)果。按照1.3.2 ③土壤接種法培養(yǎng)20 d后，接種鐮孢菌的花生苗開始出現(xiàn)萎焉的癥狀，再經(jīng)過(guò)2～3 d后癥狀明顯加劇，花生苗都表現(xiàn)為葉片和莖枯萎，植株萎蔫；而對(duì)照組花生苗長(zhǎng)勢(shì)良好，葉片新鮮且充滿活力，未現(xiàn)枯萎(圖6)。通過(guò)剖析接種鐮孢菌的花生根莖部，發(fā)現(xiàn)維管組織呈現(xiàn)出不同程度的褐變，嚴(yán)重程度表現(xiàn)為：尖孢鐮孢>層出鐮孢>茄腐鐮孢。利用李迎賓等制定的三七根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13]，對(duì)三種鐮孢菌侵染花生后的病害進(jìn)行分級(jí)統(tǒng)計(jì)，并獲得病情指數(shù)分別為：尖孢鐮孢(84%)>層出鐮孢(76%)>茄腐鐮孢(64%)。

3 討 論

引起植物根腐病的鐮孢菌種類繁多，牛世全等[14]發(fā)現(xiàn)引發(fā)黃芪根腐病的主要致病菌為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和茄腐鐮孢菌(F.solani)；馬鈴薯根腐病的主要致病菌為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)及茄腐鐮孢菌 (F.solani)[15-16]；近期報(bào)道當(dāng)歸根腐病的病原菌為燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)和銳頂鐮孢菌 (F.acuminatum)[17]，玉竹根腐病的致病菌為銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)[18]。而對(duì)于花生根腐病的病原菌鑒定，實(shí)驗(yàn)室前期只鑒定到鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)菌群，未進(jìn)行深入鑒定及分類研究[19]。本研究在已有基礎(chǔ)上得到上述結(jié)果，明確了三種鐮孢菌均能致病，并鑒定出優(yōu)勢(shì)菌株為尖孢鐮孢菌。

三種接種方式鑒定鐮孢菌致病力的方法存在各自優(yōu)缺點(diǎn)。菌絲塊接種胚軸的方法是最簡(jiǎn)便快速的，能有效區(qū)分致病力之間的差別，缺點(diǎn)是菌絲塊接種只能側(cè)面反映菌株致病力，對(duì)于能夠產(chǎn)生分生孢子的病原菌而言，分生孢子的致病力分析才是最重要的。孢子液浸根接種法是最直接的，孢子直接接觸花生根系，但缺點(diǎn)是致病力差異小的菌株之間不能明顯區(qū)分開，像試驗(yàn)中層出鐮孢菌和茄腐鐮孢菌呈現(xiàn)的致病力差異不明顯。土壤接種法是最接近田間病害發(fā)生的一種方法，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)。因此，分析病原菌致病力需綜合多種方法才更能全面地反映病原菌的致病力。