鄒凡 趙云峰 劉明

慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease , COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病狀態(tài)，與肺對(duì)有害顆?；驓怏w，特別是香煙煙霧的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。長(zhǎng)期吸煙引起的炎癥被認(rèn)為是慢性阻塞性肺病的重要發(fā)病機(jī)制之一。CD8+T淋巴細(xì)胞分為殺傷性T淋巴細(xì)胞(Tc)和抑制性T淋巴細(xì)胞(Ts)兩類。Tc細(xì)胞亞群包括Tc0、Tc1和Tc2，其中Tc1主要分泌IFN-γ、IL-2，不分泌IL-4，而Tc2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，不分泌IFN-γ。目前穩(wěn)定期COPD患者的研究發(fā)現(xiàn)在COPD炎癥進(jìn)展過(guò)程中Tc2細(xì)胞具有保護(hù)作用，Tc1細(xì)胞具有破壞作用，穩(wěn)定期COPD患者存在Tc1/Tc2失衡。但對(duì)于急性加重期的COPD患者是否存在Tc1/Tc2失衡以及香煙煙霧對(duì)Tc1/Tc2平衡的影響，并未深入研究。本研究動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2比值及相關(guān)指標(biāo)，探討其在COPD患者中的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

本研究是一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，納入2018年7月至2019年8月上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院呼吸內(nèi)科病房收治的COPD(C級(jí)、D級(jí))患者90例，其中男性64例，女性26例，年齡50-76(中位64.8)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合2018年GOLD指南[1]中COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重各器官功能不全，各組織器官或者系統(tǒng)惡性腫瘤，使用免疫相關(guān)的藥品，除外合并相關(guān)的免疫缺陷疾??；(2)嚴(yán)重肺間質(zhì)纖維化疾病，存在嚴(yán)重的組織器官感染；(3)近期發(fā)生過(guò)心肌梗死、腦卒中，近期進(jìn)行過(guò)重大的手術(shù)等；(4)近期患有傳染性疾病，或傳染性疾病恢復(fù)期；(5)其他研究者認(rèn)為不宜納入的特殊人群。所有入組患者均簽署知情同意書(shū)，本研究已通過(guò)上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、分組

根據(jù)吸煙狀態(tài)不同，將COPD患者分為三組，不吸煙者為A組，戒煙者為B組，吸煙者為C組，每組各30例，A組男18例，女12例，中位年齡為67.5歲；B組男22例，女8例，中位年齡為64.8歲；C組男24例，女4例，中位年齡62.2歲。并隨機(jī)選取10名健康者(不吸煙)作為正常對(duì)照組(D組)，四組研究對(duì)象在年齡、性別方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A、B、C三組患者給予吸氧、抗感染、平喘及其他對(duì)癥治療。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)每組研究對(duì)象在入院時(shí)、出院時(shí)、出院6個(gè)月、出院12月的誘導(dǎo)痰中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、TC1/TC2比值以及肺功能，并記錄入組患者1年內(nèi)急性加重次數(shù)。

三、研究方法

1 誘導(dǎo)痰采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)痰方法[2]，合格的痰標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)：涂片檢查每低倍鏡視野見(jiàn)白細(xì)胞>25個(gè)，鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)，無(wú)唾液成分的痰液重量>1 g。如果細(xì)胞存活率低于50%和/或鱗狀細(xì)胞污染超過(guò)20%，則認(rèn)為標(biāo)本不合格。痰液標(biāo)本至少2 mL，加入0.1%二硫蘇糖醇(Sigma, USA)，然后加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。 混合溶液進(jìn)行過(guò)濾離心，得到的細(xì)胞再次溶于PBS中并準(zhǔn)備進(jìn)行下一步檢測(cè)。

2 誘導(dǎo)痰中TC1與TC2檢測(cè) 嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀的操作流程，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(Gallios機(jī)型，Beckman公司)檢測(cè)，擴(kuò)增細(xì)胞的操作是在37℃加濕環(huán)境下5小時(shí)，利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑布雷非德菌素A(Enzo Life Sciences)里面加入佛波豆蔻醋酸25 ng/ml (Enzo Life Sciences; PA, USA) 和離子霉素1 μg/ml (Enzo Life Sciences) 進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。利用擴(kuò)增完后的細(xì)胞進(jìn)行處理固定，采用抗IFN-藻紅蛋白-7和抗IL-4-藻紅蛋白鼠抗人抗體(eBiosciences)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用Kaluza軟件分析，結(jié)果用CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比以及Tc1/Tc2的比值進(jìn)行表示。分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞為T(mén)c1細(xì)胞，分泌IL-4的CD8+T細(xì)胞為T(mén)c2細(xì)胞。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、隨訪期間各相關(guān)指標(biāo)的比較

各組時(shí)間點(diǎn)測(cè)量值進(jìn)行球行檢驗(yàn)，P>0.05，滿足“球?qū)ΨQ”假設(shè)，目前國(guó)外研究也顯示Tc1/Tc2比值等值與時(shí)間長(zhǎng)短并未顯示相關(guān)性。A、B、C組研究對(duì)象誘導(dǎo)痰中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、Tc1/Tc2比值、FEV1%的比值與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A、B、C三組研究對(duì)象組間比較：三組入院時(shí)、出院時(shí)、隨訪1年后誘導(dǎo)痰CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、Tc1/Tc2比值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A、B、C組研究對(duì)象組內(nèi)比較：各組入院時(shí)誘導(dǎo)痰CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、Tc1/Tc2比值均高于出院時(shí)和隨訪1年后，而各組入院時(shí)FEV1%低于出院時(shí)和隨訪一年后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組與B組的FEV1%值在各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組的各時(shí)間點(diǎn)的FEV1%值低于A組與B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。以上誘導(dǎo)痰中的數(shù)值均來(lái)源流式細(xì)胞分析(見(jiàn)圖1、2)。

圖1 流式細(xì)胞儀分析入院時(shí)各組誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2比值

圖2 流式細(xì)胞儀分析出院時(shí)各組誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2比值

表1 4組研究對(duì)象誘導(dǎo)痰中相關(guān)指標(biāo)及肺功能的比較

二、相關(guān)性分析

隨訪1年，A、B、C三組研究對(duì)象急性加重次數(shù)統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)值范圍(2～5次)，整體數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，A組：2.82±0.81次，B組：3.36±1.24次，C組：4.87±1.18次，兩兩比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。A、B、C三組研究對(duì)象誘導(dǎo)痰中的Tc1/Tc2比值與FEV1%以及1年內(nèi)急性加重次數(shù)的相關(guān)性研究顯示：誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2比值與FEV1%呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與COPD患者1年內(nèi)急性加重次數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

討 論

COPD是一種具有不完全可逆的氣流受限、進(jìn)行性進(jìn)展的慢性炎癥性疾病，可累及到氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管。吸煙是公認(rèn)的引起COPD最重要的危險(xiǎn)因素之一，香煙煙霧可以引起組織慢性炎癥反應(yīng)外，還可以使蛋白水解酶的活力增強(qiáng)、氧化應(yīng)激水平增高、氣道上皮細(xì)胞凋亡與增生的失衡[3-5]。

CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)肺組織細(xì)胞死亡和組織損傷，在肺組織的炎癥反應(yīng)中，誘導(dǎo)痰中的指標(biāo)較血液樣本更準(zhǔn)確以及重復(fù)性更好。在某些免疫炎癥指標(biāo)的檢測(cè)中，肺泡灌洗液和血液樣本會(huì)因?yàn)榫彌_液等的稀釋，誘導(dǎo)痰中的相關(guān)炎癥指標(biāo)較前兩者高3～5倍。另外細(xì)胞學(xué)檢測(cè)中，相較于全身來(lái)源的血液樣本，誘導(dǎo)痰受相關(guān)炎癥介導(dǎo)激活的有效細(xì)胞更高[6]。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)一些對(duì)于穩(wěn)定期COPD患者誘導(dǎo)痰中相關(guān)炎癥指標(biāo)的研究，但急性期以及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CD8+T淋巴細(xì)胞水平則罕有報(bào)道。Anders Andersson等關(guān)于吸煙與COPD患者CD8+分子的相關(guān)研究中顯示[7]：吸煙的COPD患者較非吸煙的COPD患者激活更多的CD8+T淋巴細(xì)胞。Cheng的研究也顯示[8]：COPD患者的血液樣本中CD8+T淋巴細(xì)胞的量與肺通氣功能成負(fù)相關(guān)，CD8+T淋巴細(xì)胞在肺組織的浸潤(rùn)是一個(gè)全身性的炎癥活動(dòng)，而不僅僅存在于呼吸氣道中。我們的研究顯示：A、B、C三組研究對(duì)象組內(nèi)比較時(shí)誘導(dǎo)痰中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比入院時(shí)明顯高于出院時(shí)、出院6個(gè)月及出院12個(gè)月。CD8+T淋巴細(xì)胞反映了COPD患者的炎癥水平，介導(dǎo)了COPD氣道炎癥損傷的病理過(guò)程[9-10]，我們的研究結(jié)果與國(guó)外的研究結(jié)果一致。另外，在不同吸煙狀態(tài)下的COPD患者誘導(dǎo)痰中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比數(shù)據(jù)比較中發(fā)現(xiàn)，C組患者氣道炎癥水平明顯高于A組、B組，說(shuō)明在煙霧的刺激下，吸煙的COPD患者處于更高的CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫狀態(tài)，對(duì)于氣道、肺組織產(chǎn)生破壞，并在呼吸道感染等因素影響下，介導(dǎo)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

表2 3組患者誘導(dǎo)痰Tc1/Tc2比值與有關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

CD8+T淋巴細(xì)胞在COPD患者氣道炎癥中起著重要的作用。CD8+Tc的兩個(gè)亞型為T(mén)c1(產(chǎn)生IFN-γ)和Tc2(產(chǎn)生IL-4)，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)[11]：穩(wěn)定期和急性期COPD患者中促炎CD8+T淋巴細(xì)胞以Tc1細(xì)胞為主，均高于健康非吸煙患者，而Tc2細(xì)胞在穩(wěn)定期COPD患者中顯著減少，吸煙能開(kāi)啟激活和擴(kuò)增CD8+T淋巴細(xì)胞的“扳機(jī)點(diǎn)”。日本學(xué)者Toshihiro Shirai等[12]對(duì)穩(wěn)定期COPD患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：在COPD炎癥進(jìn)展過(guò)程中Tc2細(xì)胞具有保護(hù)作用，Tc1細(xì)胞具有破壞作用。Forsslund的研究更是指出[13]：吸煙能誘導(dǎo)降低Tc2細(xì)胞的表達(dá)水平。吸煙促進(jìn)COPD患者的炎癥加重，導(dǎo)致破壞性細(xì)胞增多與保護(hù)性細(xì)胞減少。COPD患者存在Tc1/Tc2細(xì)胞失衡，且是以Tc1爆發(fā)為主的慢性炎癥性疾病。我們的研究顯示：A、B、C組患者入院時(shí)，誘導(dǎo)痰CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、Tc1/Tc2比值均高于出院時(shí)以及1年內(nèi)各隨訪時(shí)間節(jié)點(diǎn)上數(shù)值，COPD的急性加重期與穩(wěn)定期存在Tc1與Tc2兩種細(xì)胞的不平衡分化，C組入院時(shí)CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、Tc1/Tc2比值高于A組、B組，說(shuō)明不同吸煙狀態(tài)下的COPD患者氣道也存在Tc1/Tc2失衡，這種免疫狀態(tài)的不協(xié)調(diào)導(dǎo)致機(jī)體在抗擊外來(lái)病原體的同時(shí)損傷了自身的組織細(xì)胞，大量Tc1細(xì)胞在肺和氣道黏膜的局部聚集可能導(dǎo)致持續(xù)性慢性炎癥。

Cheng[8]的研究顯示香煙煙霧促進(jìn)了CD8+T淋巴增殖并抑制其凋亡，同時(shí)促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖和凋亡，其作用效果可以被毒蕈堿激動(dòng)劑和拮抗劑所模擬。吸煙的作用類似于反復(fù)的病毒感染或其他的急性加重原因誘發(fā)或直接導(dǎo)致COPD患者的急性加重[14]。我們的研究顯示：C組患者的FEV1%明顯低于A組和B組，而急性加重次數(shù)則高于其他組。不同的吸煙狀態(tài)影響COPD患者的通氣功能以及急性加重次數(shù)。我們將誘導(dǎo)痰Tc1/Tc2比值與COPD患者肺功能指標(biāo)及1年內(nèi)急性加重次數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析顯示：誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2比值與患者的肺功能FEV1%呈負(fù)相關(guān)，與COPD患者1年內(nèi)急性加重次數(shù)呈正相關(guān)性。COPD患者誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2比值增大、出現(xiàn)失衡能對(duì)COPD患者通氣功能以及病情嚴(yán)重程度具有一定的預(yù)測(cè)作用。

綜上所述，吸煙導(dǎo)致COPD患者氣道呈現(xiàn)高的炎癥水平，誘導(dǎo)痰中Tc1/Tc2失衡可能與COPD患者急性加重相關(guān)，可能作為一種新的生物學(xué)標(biāo)記物用來(lái)評(píng)估COPD患者病情嚴(yán)重程度。本研究不足之處為單中心、小樣本的臨床研究，今后還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)擴(kuò)大樣本量、干預(yù)性的試驗(yàn)，并開(kāi)展多中心、隨機(jī)、雙盲的對(duì)照研究，以進(jìn)一步探討誘導(dǎo)痰Tc1/Tc2失衡影響COPD患者急性加重的確切關(guān)系及內(nèi)在機(jī)制。