李彬彬 姜 敏 王超然 蔣璐劍 周 琴 左明煥 姜 苗

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腫瘤科，北京 100078；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

胃癌最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率與死亡率均呈升高趨勢(shì)[1]。中醫(yī)藥是胃癌治療中不可或缺的一環(huán)。中醫(yī)古籍中并未提及“胃癌”的病名，現(xiàn)一般根據(jù)胃癌的疾病表現(xiàn)將其歸入“積聚”“伏梁”“胃反”“癥瘕”等范疇，論其病機(jī)為“本虛標(biāo)實(shí)”，即以脾胃虛弱為本，痰凝、氣滯、瘀血、毒聚為標(biāo)。李星等[2]通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)分析得出胃癌證型中最常見(jiàn)的是瘀毒內(nèi)阻證，可見(jiàn)“血瘀”為胃癌發(fā)生的重要因素。名老中醫(yī)是國(guó)家及各省市根據(jù)臨床工作與理論傳承評(píng)選出的對(duì)中醫(yī)藥工作有重點(diǎn)貢獻(xiàn)的人物，對(duì)胃癌的治療有豐富的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)血瘀的治療各有其獨(dú)到的見(jiàn)解，但尚缺乏相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)，故本文通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)的系統(tǒng)挖掘得出名老中醫(yī)從瘀論治胃癌的關(guān)鍵藥物，并以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)解釋活血化瘀藥物作用于胃癌的主要活性成分及作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

計(jì)算機(jī)檢索2000 年1 月1 日—2019 年10 月1 日內(nèi)中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬(wàn)方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)（Wanfang Data）、維普中文期刊服務(wù)平臺(tái)（VIP）數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合人工檢索相關(guān)書(shū)籍。以2015 年版《胃癌臨床實(shí)踐指南》[3]及《中國(guó)藥典》[4]為標(biāo)準(zhǔn)納入病例并收集名老中醫(yī)從論治胃癌的處方。將處方藥物錄入并上傳至古今醫(yī)案云平臺(tái)（V1.5.6），在“中藥配伍”的“關(guān)聯(lián)分析”中得到相關(guān)關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果。應(yīng)用“復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖分析”功能，調(diào)節(jié)“邊權(quán)重”為12，得出核心藥物組合。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制及關(guān)鍵干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

1.2.1 核心藥物活性化合物及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)和平臺(tái)（TCMSP）中以所得核心藥物為關(guān)鍵詞，并按照口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18 篩選化合物。此外，在TCMSP 獲得篩選所得的化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/），限定物種為人，將所有靶基因名稱(chēng)校正為其官方名稱(chēng)，剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)成分及重復(fù)靶點(diǎn)。

1.2.2 疾病靶點(diǎn)的確定及交集靶點(diǎn)的收集 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）及在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）中通過(guò)檢索關(guān)鍵詞“gastric cancer”，收集胃癌相關(guān)靶點(diǎn)，利用韋恩（Venn）圖顯示藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https//string-db.org/）繪制蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用R 軟件（Version 3.6.1）得到PPI 可視化圖形，根據(jù)度值（degree）＞30 篩選核心靶點(diǎn)，建立“中藥成分-核心靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 建立網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 靶點(diǎn)的分子功能/生物過(guò)程和通路富集分析 在R 軟件中安裝相關(guān)軟件包，以P ＜0.05、Q ＜0.05 進(jìn)行關(guān)鍵靶基因基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 藥物關(guān)聯(lián)度分析

共納入68 首處方，38 種藥物，挖掘得到6 條關(guān)聯(lián)規(guī)則。見(jiàn)表1。

表1 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.2 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析

復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖分析得出核心活血化瘀藥物組合為當(dāng)歸、石見(jiàn)穿、丹參、莪術(shù)、延胡索、桃仁、三棱、紅花。見(jiàn)圖1。

圖1 核心活血化瘀藥物組合

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 中藥化合物篩選及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)收集 共收集到8 味核心藥物所含化合物171 個(gè)，經(jīng)去重、刪除無(wú)靶點(diǎn)化合物后共得到131 個(gè)有效化合物，對(duì)應(yīng)123 個(gè)靶點(diǎn)。其中，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)≥10 的化合物31 個(gè)。見(jiàn)表2。

2.3.2 疾病靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)收集 檢索GeneCards 及OMIM 得到與胃癌對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)1254 個(gè)，將藥物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與胃癌對(duì)應(yīng)的123 個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配分析，得到62 個(gè)核心藥物有效作用靶點(diǎn)，應(yīng)用Venn 圖見(jiàn)圖2。

表2 核心藥物主要化合物信息

圖2 交集靶點(diǎn)Venn 圖

2.3.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及可視化分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析，篩選出16 個(gè)核心作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4，分別是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、ESR1、ALB、IL6、MAPK8、VEGFA、ERBB2、FOS、AR、MDM2、CYCS、CASP8、RELA，提示這些核心作用靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。

2.3.4 網(wǎng)絡(luò)特征分析 經(jīng)上述可得核心藥物對(duì)胃癌的16 個(gè)核心有效靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)52 個(gè)中藥成分，見(jiàn)圖5。網(wǎng)絡(luò)中連接度前6 的中藥成分為槲皮素、木犀草素、黃芩素、β-胡蘿卜素、山奈酚和丹參酮ⅡA。

2.3.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 通過(guò)關(guān)鍵靶基因，共富集1327 個(gè)生物學(xué)過(guò)程和功能，根據(jù)校正后P 值進(jìn)行排序，選擇生物過(guò)程、分子功能及細(xì)胞成分前10 個(gè)進(jìn)行條形圖展示，見(jiàn)圖6（封四），共富集38 條通路，根據(jù)校正后P 值進(jìn)行排序，選擇前20 個(gè)進(jìn)行氣泡圖展示，見(jiàn)圖7（封四）。

圖3 交集靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點(diǎn)可視化分析

圖5 “中藥成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血瘀證貫穿始終，葉天士曾指出“久病入絡(luò)”“久病必有瘀”，王捷虹課題組[5]通過(guò)跟蹤324 例胃癌前病變患者2 年，得出“毒瘀交阻”是其發(fā)生癌變的核心病機(jī)，解毒化瘀兼益氣養(yǎng)陰法能有效阻止其癌變。名老中醫(yī)陳光偉認(rèn)為中晚期胃癌多為虛實(shí)夾雜，而實(shí)邪主要有熱、瘀、毒、痰[6]。名老中醫(yī)劉沈林認(rèn)為胃癌晚期治療以健脾養(yǎng)正消癥法為主，選方可參照健脾資生丸合血癥丸[7]。故在胃癌治療的不同時(shí)期均可應(yīng)用活血化瘀藥物。

本研究得出名老中醫(yī)治療胃癌血瘀證的核心藥物為當(dāng)歸、石見(jiàn)穿、丹參、莪術(shù)、延胡索、桃仁、三棱、紅花。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析可得關(guān)聯(lián)度較強(qiáng)的藥對(duì)組合有三棱-莪術(shù)、紅花-桃仁。研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，紅花-桃仁藥對(duì)可改善胃癌血瘀證患者的凝血指標(biāo)，降低血液黏度。張瑩等[10]發(fā)現(xiàn)三棱、莪術(shù)組方可通過(guò)降低胃癌移植瘤裸鼠血清環(huán)氧合酶-2（COX-2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。石見(jiàn)穿、丹參與當(dāng)歸均對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用[11-13]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可得活血化瘀核心藥物主要活性成分有槲皮素、木犀草素和黃芩素等。GO 功能分析集中在類(lèi)固醇激素反應(yīng)、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞核受體活性等方面。槲皮素可調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)FOS、AHR、JUN 等可能是槲皮素在胃癌中的作用靶點(diǎn)[14]。而山奈酚可通過(guò)上調(diào)miR-181a、抑制多種通路來(lái)抑制胃癌SNU-216 細(xì)胞的活力和增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬[15]。提示核心藥物的幾種主要成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)miRNAs 及核外多種蛋白酶來(lái)影響一系列通路，主要通路有PI3K-Akt 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、MAPK 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等。細(xì)胞凋亡與Bcl-2 家族蛋白和caspase 家族蛋白密切相關(guān)，同時(shí)與PI3K-Akt 信號(hào)通路及MAPK 信號(hào)通路等多條通路有關(guān)[16]。PI3K-Akt 信號(hào)通路是影響細(xì)胞周期的重要通路，PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化可激活MTOR通路，從而促使腫瘤細(xì)胞從G0/G1期向S 期進(jìn)展[17]。MAPK 包括多種信號(hào)途徑，其中JNK、p38 MAPK 與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[18]。實(shí)驗(yàn)證明，核心藥物所含木犀草素[19]、黃芩素[20]與山奈酚[15]均可通過(guò)PI3K-Akt 信號(hào)通路或者M(jìn)APK 信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)體腫瘤的迅速生長(zhǎng)使中心區(qū)域氧氣供應(yīng)不足，激活HIF-1，VEGF 被認(rèn)為是HIF-1 的下游基因，可促進(jìn)胃癌血管生成，與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。所以推測(cè)核心藥物可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管新生來(lái)控制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。PI3K-Akt 信號(hào)通路與HIF-1 通路也與化療和靶向藥物的耐藥有關(guān)[21]。實(shí)驗(yàn)證明，黃芩素可能通過(guò)HIF-1α 通路下調(diào)藥物外排功能，從而逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的胃癌5-FU 耐藥。β-胡蘿卜素是一種常見(jiàn)的抗氧化物，存在于多種果蔬及藥物之中。研究表明，β-胡蘿卜素對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的胃癌高危人群具有保護(hù)性作用[23]。丹參酮ⅡA 可以抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)阿霉素對(duì)耐藥胃癌細(xì)胞的抗癌作用[24-25]。由以上分析，可推測(cè)核心藥物通過(guò)多種成分從不同通路影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療耐藥，影響血管生成等，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的整體調(diào)節(jié)特點(diǎn)。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)名老中醫(yī)治療胃癌血瘀證的核心藥物的作用機(jī)制進(jìn)行探討，結(jié)果顯示核心活血化瘀藥物的主要潛在活性成分及作用靶基因與胃癌作用通路的關(guān)系，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供新思路，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。