熊旺，姜荷，華家才，何光華，楚秉泉，肖海龍，肖功年

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023；2.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州310000；3.貝因美嬰童食品股份有限公司，杭州310000）

0 引 言

多不飽和脂肪酸能調(diào)節(jié)人體脂質(zhì)代謝、治療和預(yù)防心腦血管疾病、促進(jìn)生長發(fā)育及延緩衰老，具有多種生理功能[1-2]。大量實(shí)驗(yàn)[3-4]證明，攝入一定量不飽和脂肪酸的動(dòng)物，其行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的成績(jī)較好。也有研究者用衰老的小鼠做實(shí)驗(yàn)，證明攝入一定量的DHA能夠減緩認(rèn)知能力的下降[5-6]。

ω-6與ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)人體健康具有協(xié)同作用，研究攝入不同比例的ω-6和ω-3 PUFAs對(duì)人體健康尤其是高齡群體大腦健康的影響具有重要意義。DHA和AA是腦部重要的營養(yǎng)物質(zhì)，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[7]。本文以富含DHA和AA油脂作為主要不飽和脂肪酸源，通過一系列行為學(xué)和生理實(shí)驗(yàn)來研究其不同配比的飼喂對(duì)中老年小鼠認(rèn)知與記憶力方面的影響，為開發(fā)預(yù)防記憶力下降的中老年配方奶粉奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

來自杭州市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的12月齡ICR小鼠60只，全為雄性，體質(zhì)量（48±5）g。飲水及飼料經(jīng)高溫蒸汽滅菌，飼料為購買的實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料，飼養(yǎng)期間小鼠自由飲食。動(dòng)物飼養(yǎng)在杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，動(dòng)物及相關(guān)設(shè)施均通過合格。動(dòng)物室溫度22～26℃，相對(duì)濕度維持在60%±10%，12 h光/12 h暗循環(huán)下飼養(yǎng)。

1.2 材料與儀器

本研究所用到的油脂是從嘉必優(yōu)生物科技有限公司購買的DHA藻油和AA藻油以及從市面上購買的棕櫚油，根據(jù)GB 5009.168-2016氣相色譜法測(cè)定其脂肪酸組成如表1所示。實(shí)驗(yàn)所用到的試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，包括TG，TC，HDL-C，T-SOD，MDA及Aβ-40淀粉樣蛋白試劑盒。

主要儀器：Morris水迷宮系統(tǒng)，上海欣軟科技有限公司；Y型小鼠迷宮，上海欣軟科技有限公司；酶標(biāo)儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；島津氣相色譜儀。

表1 實(shí)驗(yàn)中3種油脂的主要脂肪酸組成（質(zhì)量比）

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與劑量分組

將實(shí)驗(yàn)小鼠分為6組，每組10只，根據(jù)ω-3/ω-6不飽和脂肪酸的不同配比進(jìn)行分組，所有試驗(yàn)組灌胃1.0 g/(kg·d)的復(fù)合油脂，以棕櫚油灌胃組作為同等熱量的對(duì)照，以滅菌的蒸餾水作為空白對(duì)照，灌胃劑量都為1g/(kg·d)，具體分組如表2所示。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，每周稱量1次體重，調(diào)整給藥量，灌胃一共持續(xù)6周。

1.3.2 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試

給藥第6周開始進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試[8-10]，為期6 d，期間持續(xù)給小鼠灌胃油脂。Morris水迷宮包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。圓形水池直徑為120 cm，水池高55 cm。水溫（23±2）°C，水深26 cm，分為東南、西南、西北、東北4個(gè)象限，在4個(gè)象限高于水面的內(nèi)壁上分別貼上不同形狀的標(biāo)識(shí)物，實(shí)驗(yàn)期間保持室內(nèi)環(huán)境和擺設(shè)不變。透明平臺(tái)直徑8 cm，放置在東南象限中央的水面下1 cm，迷宮上空通過攝像機(jī)追蹤小鼠軌跡。通過定位航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行歷時(shí)5 d的游泳訓(xùn)練（前一天讓小鼠適應(yīng)性自由泳90 s)。

表2 小鼠灌胃分組 g/（kg·d）

每天將小鼠面向池壁分別從不同象限放入池中，每個(gè)象限1次，共4次，每次間隔10 min，記錄每次的潛伏期(s)，計(jì)算平均值。潛伏期是指小鼠找到平臺(tái)所花的時(shí)間。若小鼠在60 s內(nèi)未找到水下平臺(tái)，則引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)10 s（潛伏期記為60 s）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)是在定位航行實(shí)驗(yàn)后去除水下平臺(tái)，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)和停留在目標(biāo)象限（東南象限）的時(shí)間（圖1）。

圖1 水迷宮示意圖

1.3.3 小鼠Y迷宮行為測(cè)試

Y迷宮測(cè)試[11]在Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束的后1 d進(jìn)行，Y迷宮由3個(gè)相同的有色臂組成（8 cm×30 cm×15 cm），相鄰臂之間的角度為120°，每個(gè)臂的末端都裝有一個(gè)擋板控制開關(guān)。3只臂被指定為：起始臂（總是打開，小鼠每次探索迷宮的起始點(diǎn)；其它臂（始終打開）；新異臂（在第1次實(shí)驗(yàn)中被擋住，在2次實(shí)驗(yàn)開始前打開）。在迷宮的內(nèi)壁上貼上不同形狀的標(biāo)志物供小鼠識(shí)別。Y迷宮試驗(yàn)由兩個(gè)部分組成，間隔1 h。第一次部分試驗(yàn)持續(xù)5 min，讓老鼠自由探索兩臂（起始臂和其它臂），封鎖新異臂。在第二部分試驗(yàn)也持續(xù)5 min，3只臂同時(shí)打開，將小鼠放在起始臂前端，使小鼠可以自由探索所有臂。每次試驗(yàn)后，將迷宮內(nèi)壁清理干凈，以去除嗅覺信號(hào)。實(shí)驗(yàn)由安裝在迷宮上方的攝像機(jī)記錄并分析。統(tǒng)計(jì)首次進(jìn)入新異臂的小鼠個(gè)數(shù)以及每只小鼠分別進(jìn)入新異臂和其它臂的總次數(shù)。

1.3.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，禁食不禁水12 h后脫頸椎處死，主動(dòng)脈取血然后于冰浴中迅速分離大腦，腦組織加入9倍生理鹽水進(jìn)行勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液保存。按試劑盒說明步驟測(cè)定大腦Aβ-40淀粉樣蛋白水平，試劑盒標(biāo)曲用ELISA數(shù)據(jù)處理軟件做Logistic4參數(shù)曲線擬合。同時(shí)用TG、TC及HDL-C試劑盒測(cè)定小鼠血脂水平，T-SOD、MDA試劑盒測(cè)定血清、大腦組織的過氧化水平。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±SE表示,各組之間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

圖2為復(fù)配不飽和脂肪酸油脂對(duì)高齡小鼠在水迷宮中潛伏期的影響。

如圖2所示，隨著訓(xùn)練的進(jìn)行，所有的小鼠都學(xué)會(huì)了在60 s內(nèi)找到隱藏的水下平臺(tái)。在第1天訓(xùn)練中，各組小鼠尋找平臺(tái)的平均潛伏期無明顯差異；從第2天開始，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多，各組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均呈下降趨勢(shì)，但各組間無明顯差異（P＞0.05）；從第3天開始，各組間表現(xiàn)出了差異，其中，C組和D組較A和B兩組（對(duì)照組）潛伏期明顯縮短（P＜0.05），且隨后幾天組間差距并沒有縮小，而E和F兩組雖然表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照組，但無顯著性差異（P＞0.05）。這說明高含量的不飽和脂肪酸攝入有利于縮短中老年小鼠的逃避潛伏期，增強(qiáng)空間記憶能力，且ω-3較優(yōu)于ω-6不飽和脂肪酸。

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

水迷宮中目標(biāo)象限停留時(shí)間和跨越平臺(tái)次數(shù)可以反映小鼠的空間記憶能力，認(rèn)知及記憶能力好則小鼠會(huì)來回的在平臺(tái)周圍搜索，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增加。如表3所示，不飽和脂肪酸油脂組（C，D和E組）在目標(biāo)象限停留時(shí)間和跨越平臺(tái)次數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且D組（DHA藻油/AA藻油=1∶1）整體表現(xiàn)最好。

2.2 Y迷宮新異臂探索實(shí)驗(yàn)

新異臂探索實(shí)驗(yàn)[12]是利用小鼠對(duì)新異環(huán)境天然探究的能力來研究其記憶認(rèn)知能力的，無需外界的刺激。當(dāng)允許在新異臂和其它臂之間進(jìn)行選擇時(shí)，具有較好的空間記憶的小鼠，會(huì)更多的進(jìn)入新異臂。圖2(a)中，對(duì)新異臂首次進(jìn)入的小鼠個(gè)數(shù)分析，只有C組和D組小鼠對(duì)新異臂表現(xiàn)出明顯的偏好性（P＜0.05），小鼠總數(shù)相同的情況下，首次進(jìn)入新異臂的小鼠數(shù)量最多。小鼠總進(jìn)臂次數(shù)無明顯差異，活動(dòng)能力相同，圖2(b)中，多不飽和脂肪酸組（C組和D組）對(duì)新異臂表現(xiàn)出了更大的興趣，進(jìn)入次數(shù)明顯最多（P＜0.05）。

表3 復(fù)配不飽和脂肪酸油脂對(duì)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間的影響

圖3 復(fù)配多不飽和脂肪酸對(duì)高齡小鼠Y迷宮新奇事物探索能力的影響

2.3 小鼠生化指標(biāo)分析

在給藥期間，各組小鼠體重變化無明顯差異，臟器指數(shù)均無明顯差異。所有實(shí)驗(yàn)小鼠胸腺明顯萎縮。

2.3.1 小鼠血脂水平分析

長期高膳食飽和脂肪酸會(huì)引起血脂水平的升高，提高機(jī)體氧化應(yīng)激水平[13]，進(jìn)而加快機(jī)體的氧化損傷，但本研究中小鼠血脂水平?jīng)]有明顯差異（P＞0.05），這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)間過短，同時(shí)也說明較高劑量的多不飽和脂肪酸油脂攝入不會(huì)引起血脂水平的明顯升高，見表4。

2.3.2 氧化應(yīng)激水平

與棕櫚油組（A組）相比，多不飽和脂肪酸油脂組大腦與血清的MDA水平顯著降低(P＜0.05)，D油脂組大腦T-SOD水平顯著升高(P＜0.05)。說明多不飽和脂肪酸油脂對(duì)小鼠機(jī)體有抗氧化作用，見表5。

表4 小鼠血脂水平 mmol/L

表5 小鼠體內(nèi)過氧化水平

2.3.3 小鼠大腦Aβ-40淀粉樣蛋白質(zhì)量濃度分析

Aβ蛋白與老年斑的形成有關(guān)，老年人體內(nèi)Aβ蛋白質(zhì)量濃度會(huì)明顯增加。AD的發(fā)病與腦內(nèi)Aβ淀粉樣蛋白異常沉淀也有關(guān)。Aβ對(duì)周圍的突觸和神經(jīng)元具有毒性作用，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性死亡，隨著神經(jīng)元的變性壞死,導(dǎo)致腦內(nèi)相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)水平下降，從而引起記憶力的衰退[14-15]，見表6。

表6 復(fù)配多不飽和脂肪酸油脂對(duì)高齡小鼠大腦Aβ-40淀粉樣蛋白水平的影響 ng/L

如表6所示，不飽和脂肪酸油脂能顯著降低高齡小鼠大腦組織中Aβ-40淀粉樣蛋白水平（P＜0.05），C、E兩組與對(duì)照組B相比差異極其顯著（P＜0.01）。對(duì)照組中棕櫚油組與蒸餾水組相比，Aβ-40蛋白含量也有明顯下降（P＜0.05），可能是棕櫚油中含有其它豐富的不飽和脂肪酸，而小鼠日常的維持飼料脂肪酸供給不足。

3 結(jié)束語

通過Morris水迷宮法與Y迷宮法，從不同的角度觀察了經(jīng)多不飽和脂肪酸灌胃后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及相應(yīng)變化。同時(shí)，在迷宮實(shí)驗(yàn)完成后測(cè)定小鼠大腦Aβ-40淀粉樣蛋白水平和過氧化水平作為迷宮實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充。結(jié)果說明：多不飽和脂肪酸可以保護(hù)高齡小鼠認(rèn)知及記憶能力，且ω-3可能比ω-6多不飽和脂肪酸更有效，但綜合ω-6不飽和脂肪酸的重要作用[16]，合理的脂肪酸營養(yǎng)配比是十分重要的，本實(shí)驗(yàn)中D油脂組（DHA藻油/AA藻油=1∶1）小鼠整體表現(xiàn)最好。大腦的記憶是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，雖然在本實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出了復(fù)配ω-3/ω-6不飽和脂肪酸在高齡小鼠衰老過程中記憶力良好的保護(hù)作用及抗氧化損傷作用，但兩者的關(guān)聯(lián)和作用途徑還需要進(jìn)一步研究，以便為中老年配方奶粉中脂肪酸的添加提供更好的依據(jù)。