白英，殷佳棋，蘭秀芬，王純瑋

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018）

0 引 言

由于乳酸菌水解蛋白的能力很弱，以MRS作為培養(yǎng)基滿(mǎn)足不了乳酸菌對(duì)氨基酸的營(yíng)養(yǎng)需求，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢[1]。而添加來(lái)源于禽肉加工殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)水解物，可促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)[2]。2%的乳清蛋白可明顯促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)[3]。酪蛋白水解物可使雙歧桿菌的活菌數(shù)和胞外多糖(exopo lysaccharides,EPS)產(chǎn)量均達(dá)到最高[4]。乳清蛋白水解物(Whey Protein H ydro lysate,WPH)可增加嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)及胞外多糖的產(chǎn)量[5]。K itagishi[6]等發(fā)現(xiàn)，酪蛋白水解物和乳清蛋白水解物均可增加胞外多糖的產(chǎn)量。將乳清蛋白水解物以不同比例替代MRS液體培養(yǎng)基可以促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)[7]。以乳清作為培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌在3 h后，活菌數(shù)達(dá)到0.42×109CFU/m L[8]。而大豆分離蛋白、牛乳清蛋白和蛋清蛋白的水解物均可促進(jìn)雙岐桿菌等乳酸菌的生長(zhǎng)[9]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

產(chǎn)胞外多糖L.paracasei LX 5，由本實(shí)驗(yàn)室分離自錫盟發(fā)酵奶油[10-11]；乳清蛋白，上海紫一試劑廠(chǎng)；堿性蛋白酶，北京酷來(lái)搏科技有限公司；茚三酮顯色劑、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇溶液等均為分析純，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)14.4～94.0 ku，天根生化科技(北京)有限公司；預(yù)染低分子量Marker，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，北京化學(xué)試劑公司；T ris、SDS，比奧羅克公司；過(guò)硫酸銨，北京化工廠(chǎng)；甘氨酸，山東豐泰生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G 250北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；MRS肉湯培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；β-巰基乙醇，上海百賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白溶液的制備流程

6%乳清蛋白→80℃水浴20min→冷卻→5 000 r/min離心10min→取上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理[12－13]，以水解度為響應(yīng)值，以溫度、pH值、酶與底物比作為自變量，設(shè)計(jì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以建立數(shù)學(xué)模型，從而得出最佳組合條件，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。以建立數(shù)學(xué)模型，分別表示為X1，X2，X3；且用+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，中心點(diǎn)進(jìn)行3次試驗(yàn)，用以估計(jì)誤差。按方程Xi=(xi-x0)/x對(duì)自變量進(jìn)行編碼，其中，Xi為編碼值，xi為真實(shí)值，x0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處的真實(shí)值，X為變化步長(zhǎng)，響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平和編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼

1.2.3 乳清蛋白SDS-PAGE電泳分析

按表2分別將超純水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%丙烯酰胺、濃縮膠緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的SDS混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%過(guò)硫酸銨和TEMED，立即混合5～10 s。先60 V電泳30～60 min至分離膠處，再150 V電泳至樣品距分離膠下沿約1 cm處，結(jié)束電泳。

表2 大分子蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳凝膠配制

1.2.4 乳清蛋白水解物T ricine-SDS-PAGE電泳分析

按表3分別將質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%聚丙烯酰胺(29∶1)、4×凝膠緩沖液、超純水混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%過(guò)硫酸銨和TEMED，立即混合5～10 s。先80 V電泳30～60 min至分離膠處，再120 V電泳至樣品距分離膠下沿約1 cm處，結(jié)束電泳。

表3 小分子蛋白質(zhì)Tricine-SDS-PAGE電泳凝膠配制

1.2.5 超濾

取兩支10 ku，1 500μL的超濾管，分別加入15m L去離子水，于冰箱中預(yù)冷10 min。將水倒出，在超濾管中分別加入10 m L的WPH溶液，轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min，收集管底的樣品，加入樣品，重復(fù)此步驟直至結(jié)束，得到10 ku上下兩部分的WPH。將分離得到的水解液于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到粉末狀的WPH。

1.2.6 WPH不同超濾成分對(duì)乳酸菌的增菌作用

將高于10 ku、低于10 ku兩個(gè)分子量范圍的WPH以0.1 g/100 m L的添加量添加到MRS液體培養(yǎng)基中(標(biāo)記為MRSⅠ、MRSⅡ)，然后將活化三代的L.paracasei LX 5接種于MRS、MRSⅠ、MRSⅡ三種培養(yǎng)基中，接種量為3%，37℃培養(yǎng)24 h。采用活菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)其對(duì)L.paracasei LX 5的增菌作用。

1.2.7 WPH不同超濾成分對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

將低于10 ku、高于10 ku兩個(gè)分子量范圍的WPH以0.1 g/100 m L的添加量添加到MRS液體培養(yǎng)基中(標(biāo)記為MRSⅠ、MRSⅡ)，將活化三代后的L.paracasei LX 5接種于MRS、MRSⅠ、MRSⅡ三種培養(yǎng)基中，接種量為3%，37℃培養(yǎng)24 h。分別取10 m L菌液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，分別加入三倍體積的95%冷乙醇，4℃過(guò)夜后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min。棄去上清液，收集管底沉淀，用蒸餾水溶解。將溶液放入透析袋中,透析12 h，每2 h更換1次蒸餾水。透析結(jié)束后采用苯酚-硫酸法[14]檢測(cè)490 nm處的吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算乳酸菌EPS的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化水解參數(shù)

2.1.1 響應(yīng)面模型的建立及統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)前期單因素實(shí)驗(yàn)確定因素水平，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以三個(gè)相關(guān)性緊密的因素(溫度、pH值、酶底比)為自變量，水解度為響應(yīng)值優(yōu)化水解參數(shù)。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析如表4所示。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合分析，確定水解度與各因素之間為二次模型關(guān)系，得到了以水解度為目標(biāo)，溫度、pH、酶與底物比為因素的二階編碼值回歸方程：

根據(jù)表5的回歸模型的方差分析及回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可看出，該響應(yīng)面模型的F值為61.93，P＜0.01，證明該回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),相關(guān)系數(shù)R2為0.9911，可得知預(yù)測(cè)值與測(cè)定值之間有高度相關(guān)性，而且模型校正決定系數(shù)RAdj=0.9751,表明此模型可以解釋97.51%響應(yīng)值的變化情況，總變異中只有1.04%的變異不可以由該模型解釋?zhuān)砻髟撃Ｐ团c實(shí)際擬合良好，各影響元素與水解度之間的實(shí)際關(guān)系可用該方程來(lái)描述，故可用此模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

表4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方差與結(jié)果

表5 水解度DH(%)響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果

由表5可以看出，X1和X2的P值小于0.05，說(shuō)明溫度和pH值對(duì)乳清蛋白水解度的影響顯著，X3的P值小于0.01，表明E/S對(duì)水解度的影響極顯著；交互項(xiàng)中X1X2，X1X3，X2X3之間的協(xié)同作用對(duì)乳清蛋白水解度的影響均不顯著；二次項(xiàng)X12,X32對(duì)水解度的影響極顯著，X22對(duì)水解度的影響不顯著。P值越小各因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，所以，溫度、pH值、酶與底物比3個(gè)因素對(duì)水解度的影響順序依次為：酶與底物比＞pH＞溫度。

2.1.2 模型的響應(yīng)面分析

根據(jù)模型分別將回歸模型中的兩個(gè)因素固定在中心點(diǎn)水平以便于直觀(guān)描述各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，構(gòu)建了另外兩個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面圖。圖1，圖2和圖3分別表示各個(gè)因素對(duì)蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖。利用響應(yīng)面可以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)蛋白水解度的兩兩交互作用，可以清楚的看到，各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)和模型具有最大值。

圖1 溫度與pH值對(duì)乳清蛋白水解度影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)

圖2 溫度與E/S對(duì)乳清蛋白水解度影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)

圖3 pH值與E/S對(duì)乳清蛋白水解度影響的響應(yīng)曲面圖及等高線(xiàn)

根據(jù)圖1和圖2可知，在因素考察的范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時(shí)，水解度呈先增高后降低的趨勢(shì)，從其等高線(xiàn)圖可知，溫度與pH值、E/S的交互作用不顯著；在溫度到達(dá)55℃左右時(shí)，水解度達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)中的最大值。由圖1、圖3可知，在因素所考察的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，水解度呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)，由等高線(xiàn)圖可知，pH值與溫度、E/S的之間的交互作用不顯著；當(dāng)pH在8.0附近有最大值。由圖2、圖3可知，在因素所考察范圍內(nèi)，隨著E/S的升高，水解度呈現(xiàn)先增高后緩慢增高趨勢(shì)，從等高線(xiàn)圖可以看出E/S與pH值、溫度的交互作用不顯著；當(dāng)E/S為0.05左右時(shí)，水解度處于最優(yōu)點(diǎn)。

2.2 最佳參數(shù)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用尋優(yōu)程序?qū)貧w模型方程進(jìn)行尋優(yōu)處理進(jìn)而明確各因素的最優(yōu)條件，得到水解度為最大值時(shí)的條件為X1=54.59，X2=8.28，X3=0.05。即溫度為54.59℃，pH值為8.28，E/S為0.05。在此最優(yōu)條件下，水解度的預(yù)測(cè)值為21.65%。按上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)此模型的有效性與可靠性?？紤]到實(shí)際情況，把實(shí)驗(yàn)參數(shù)修正為溫度55℃，pH值8.0，E/S=0.05，在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并重復(fù)3次，得到水解度的實(shí)際平均值為21.73%±0.36%。水解度的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的結(jié)果無(wú)較大差距，這證明了模型的有效性，表明響應(yīng)面法分析各因素對(duì)水解度的影響的方式值得信賴(lài)，且有實(shí)際的參考價(jià)值。

2.3 SDS-PAGE電泳分析

6%乳清蛋白溶液與6%乳清蛋白水解液的電泳結(jié)果如圖4所示。從電泳條帶可知，乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白和牛血清白蛋白4種成分。其中牛血清白蛋白的分子量在66.2 ku左右；在電泳中免疫球蛋白在β-巰基乙醇的作用下被水解為重鏈和輕鏈，輕鏈分子量25 ku，重鏈為55～75 ku，輕鏈由于擴(kuò)散在電泳中，幾乎看不到[15]。β-乳球蛋白的分子量在20.0～26.0 ku之間,α-乳白蛋白的分子量介于14.4～20.0之間。而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的WPH沒(méi)有電泳出條帶，說(shuō)明該方法不適合小分子蛋白的分離。

圖4 SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.4 T ricine-SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

6%乳清蛋白水解液的電泳結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，乳清蛋白水解液中包含3個(gè)分子量范圍的蛋白質(zhì)，分別為4.6～10，10，16～27 ku。相比于圖4，可以看出乳清蛋白中各組分的蛋白質(zhì)在堿性蛋白酶的作用下均得到了較好的降解，大分子的肽段被降解成了小分子肽段。

圖5 Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖5中，WPHⅠ為稀釋一倍的乳清蛋白水解物。

2.5 兩種電泳方法的比較

SDS-PAGE電泳和T ricine-SDS-PAGE電泳這兩種電泳方法的比較如表6所示。兩種電泳方法的區(qū)別主要體現(xiàn)在在分離膠濃度、濃縮膠濃度、電泳緩沖液配制、電壓和電泳對(duì)象這幾方面。同時(shí)說(shuō)明了SDS-PAGE電泳適合于大分子蛋白的分離，T ricine-SDS-PAGE電泳適合于小分子蛋白的分離。

2.6 WPH不同超濾成分對(duì)乳酸菌的增菌作用

WPH不同超濾成分的增菌效果如圖6所示。由圖3可以看出，L.paracasei LX 5在MRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為199.67 CFU/m L，在MRSⅠ培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為263.67 CFU/m L，在MRSⅡ培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為280.33 CFU/m L。由此可知，高于10ku的WPH和低于10 ku的WPH均表現(xiàn)出了對(duì)L.paracasei LX 5的增菌作用。低于10 ku的WPH相對(duì)于高于10 ku的WPH的增菌作用更加明顯。Lucas[16]等的研究表明，分子質(zhì)量在0.5～1.5 ku之間的乳蛋白水解肽對(duì)于嗜熱鏈球菌的增長(zhǎng)有明顯的的促進(jìn)作用。

表6 兩種電泳方法的比較

圖6 L.paracasei LX 5活菌數(shù)

2.7 WPH不同超濾成分對(duì)乳酸菌EPS產(chǎn)量的影響

2.7.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，490 nm下的吸光值為縱坐標(biāo)繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖7所示，該曲線(xiàn)與線(xiàn)性方程y=0.0094x+0.037擬合良好，R2=0.9924，葡萄糖的質(zhì)量濃度為10～100m g/L。

圖7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.7.2 乳酸菌EPS產(chǎn)量的測(cè)定

EPS的產(chǎn)生取決于培養(yǎng)基的溫度、pH值以及培養(yǎng)基中碳、氮、礦物質(zhì)和維生素含量的組成[17，18]。增加培養(yǎng)基中的氨基酸或肽的量可促進(jìn)乳酸菌的增長(zhǎng),同時(shí)可提高胞外多糖的產(chǎn)生量[19]。由圖8可以看出，L.paracasei LX 5在MRS培養(yǎng)基中的EPS產(chǎn)量為101.91 m g/L，在MRSⅠ培養(yǎng)基中的EPS產(chǎn)量為161.14 m g/L，在MRSⅡ培養(yǎng)基中的EPS產(chǎn)量為241.24 m g/L。由此可知，高于10 ku的WPH和低于10 ku的WPH均顯示出了對(duì)L.paracasei LX 5 EPS產(chǎn)量的促進(jìn)作用。低于10 ku的WPH相對(duì)于高于10 ku的WPH的對(duì)EPS產(chǎn)量的促進(jìn)作用更加明顯。

圖8 L.paracasei LX 5胞外多糖產(chǎn)量

3 結(jié) 論

經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，6%WPH沒(méi)有電泳出條帶，說(shuō)明該方法不適合小分子蛋白的分離。而經(jīng)T ricine-SDS-PAGE電泳分析，得到了WPH的三條電泳條帶，其分子量分別為4.6～10，10，16～27 ku。相比于乳清蛋白的電泳結(jié)果，可以看出乳清蛋白中各組分的蛋白質(zhì)在堿性蛋白酶的作用下均得到了較好的降解。根據(jù)T ricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果將WPH采用超濾的方法進(jìn)行分離與收集，得到高于10 ku和低于10 ku兩種組分的WPH。分別將其加入到MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，兩個(gè)分子量范圍的水解物均對(duì)L.paracasei LX 5的活菌數(shù)和EPS產(chǎn)量起到了促進(jìn)作用，且低于10 ku的水解物比高于10 ku的水解物的促進(jìn)效果更加明顯。