閆國(guó)強(qiáng)，張倩，張俊艷，金穎慧，丁洪青，尹忠英，董晶晶，李寶芬，郭煊（.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 06000；.滄縣醫(yī)院，河北 滄州 06000）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要由細(xì)胞因子參與介導(dǎo)的慢性炎癥疾病，其高發(fā)病率和致殘率嚴(yán)重影響人們的正常生活，而發(fā)病機(jī)制的不明確導(dǎo)致尚未具有較滿(mǎn)意的治療方法[1]。

中藥復(fù)方在RA 的治療中具有多通路、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)[2]，前期試驗(yàn)已證實(shí)，經(jīng)通痹膠囊能改善佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠側(cè)足紅腫、關(guān)節(jié)炎指數(shù)等病理癥狀，其機(jī)制涉及對(duì)p38MAPK/NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控[3]。JAK/STAT 途徑是多種細(xì)胞生長(zhǎng)、活化、分化、凋亡及其功能發(fā)揮過(guò)程中重要的一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]，已有研究證實(shí)，在RA 發(fā)病過(guò)程中JAK/STAT 信號(hào)通路處于激活狀態(tài)[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究通痹膠囊對(duì)AA 大鼠JAK2/STAT3 信號(hào)通路的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar 雌性大鼠48只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，均購(gòu)自于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（冀）2013-1-003]，在濕度50%～60%、溫度（24±2）℃，環(huán)境下飼養(yǎng)通風(fēng)環(huán)境良好，自由攝食、飲水。

1.2 試藥

通痹膠囊（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)：180508，規(guī)格：0.3 g/粒）；雷公藤多苷片（遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)：20170102，規(guī)格：10 mg/片）；注射用弗氏完全佐劑、烏拉坦（Sigma，USA）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、γ干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公 司）；p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 檢 測(cè)試劑盒（Immunoway，USA）。

1.3 儀器

SZ61TRC-1LST 型解剖鏡（日本Olympus 公司）；Fresco 低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；ZCLIPSE 50i 型光學(xué)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon 公司）；MultiSkan3 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Thermo 公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；電動(dòng)組織勻漿器（美國(guó)Fluka 公司）。

2 方法

2.1 AA 模型的建立與分組[6]

將48 只Wistar 大鼠隨機(jī)分為6 組，即正常組，模型組，雷公藤多苷片組，通痹膠囊低、中、高劑量組，每組8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。除正常組外，其余各組均給予弗氏完全佐劑制備AA 模型，將常規(guī)消毒后的大鼠右腿伸直，在足跖部中央皮內(nèi)注射0.1 mL 的弗氏完全佐劑。

2.2 給藥

造模后第8日開(kāi)始給藥，連續(xù)灌胃給藥4 周，每日1 次。通痹膠囊分為低、中、高劑量組[375、750、1500 mg/（kg·d）]（分別為臨床成人劑量的2、4、8 倍），雷公藤多苷片組用量為10 mg/（kg·d），給藥體積為8 mL·kg－1，正常組、模型組給予相同體積生理鹽水。

2.3 HE 染色觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化

給藥結(jié)束后剪下炎性腫脹足，去掉足部皮置于10%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)過(guò)脫鈣、脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片和HE 染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察滑膜病理組織學(xué)變化，從滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳生成、滑膜增生、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞等方面進(jìn)行病理評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)方法[6]。

2.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清及滑膜中IL-6、IFN-γ的表達(dá)水平

大鼠眼球后靜脈叢采血2 mL，3000 r·min－1離心10 min，取血清，－80 ℃冷凍備用。取血后脫頸法處死大鼠，分離滑膜組織[7]，凍于－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)，充分解凍后，將組織加入適量生理鹽水進(jìn)行勻漿，3000 r·min－1離心10 min，取上清液。根據(jù)ELISA 法，嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟檢測(cè)各組大鼠血清及滑膜中IL-6、IFN-γ的含量。

2.5 Western blot 法檢測(cè)大鼠滑膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 的蛋白相對(duì)表達(dá)

將大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織用RIPA 蛋白抽提試劑進(jìn)行組織蛋白提取，蛋白定量后，加入緩沖液煮沸變性，取20 μg 上樣。300 mA 橫流轉(zhuǎn)模3 h，3%BSA 封閉30 min。加p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 一抗，室溫孵育10 min，4℃過(guò)夜，室溫孵育30 min。TBST 洗膜3 min×5 次。加HRP 標(biāo)記的二抗（均為1∶10 000），室溫封閉2 h，TBST洗膜3 min×6 次。ECL 發(fā)光試劑盒顯色，曝光定影后用凝膠定量分析軟件TotalLab Quant 讀取條帶的積分光密度（IOD）值，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參照，Image 軟件分析計(jì)算其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)AA 大鼠關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜光滑，關(guān)節(jié)間隙無(wú)異常，無(wú)軟骨及骨的破壞，無(wú)滑膜組織增生、血管翳生成、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等異常病理現(xiàn)象；模型組大鼠滑膜組織增生嚴(yán)重，重度血管翳形成，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨及骨關(guān)節(jié)破壞明顯，出現(xiàn)嚴(yán)重RA 病理變化；經(jīng)通痹膠囊[375、750、1500 mg/（kg·d）]、雷公虅多苷片治療后，各治療組病變程度較模型組明顯減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 通痹膠囊對(duì)AA 大鼠關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)的影響（HE，×100）Fig 1 Effect of Tongbi capsule on joint histomorphology of AA rats（HE，×100）

與模型組比較，通痹膠囊低、中、高劑量組和雷公藤多苷片組大鼠關(guān)節(jié)組織病理改變均有明顯減輕（P＜0.05，P＜0.01）；與雷公藤多苷片組相比，通痹膠囊低、中劑量組關(guān)節(jié)組織病理改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；通痹膠囊高劑量組病理改善較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 AA 大鼠關(guān)節(jié)組織病理改變?cè)u(píng)分(n ＝8，± s)Tab 1 Score of pathological changes of joints in AA rats (n ＝8，± s)

表1 AA 大鼠關(guān)節(jié)組織病理改變?cè)u(píng)分(n ＝8，± s)Tab 1 Score of pathological changes of joints in AA rats (n ＝8，± s)

注（Note）：與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與雷公藤多苷片組相比，▲P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01； compared with the tripterygium wilfordii polyglycoside tablets group，▲P ＜0.05）。

組別 病理改變?cè)u(píng)分模型組 2.63±0.52通痹膠囊低劑量組 1.88±0.64*通痹膠囊中劑量組 1.38±0.52**通痹膠囊高劑量組 0.88±0.64**▲雷公藤多苷片組 1.63±0.52**

3.2 對(duì)AA 大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-6、IFN-γ 含量的影響

由表2可知，模型組大鼠血清及滑膜組織中IL-6、IFN-γ的含量明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。通痹膠囊低劑量組可顯著降低模型大鼠滑膜組織中IFN-γ的含量（P＜0.01）；通痹膠囊中劑量組可顯著降低模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6、IFN-γ的含量（P＜0.05，P＜0.01）；通痹膠囊高劑量組能夠顯著降低模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6、IFN-γ的含量（P＜0.05，P＜0.01）；雷公藤多苷片組能明顯降低滑膜組織中IFN-γ的含量（P＜0.01）。

表2 通痹膠囊對(duì)模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6 和IFN-γ 含量的影響(± s，n ＝8，pg·mL－1)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on the content of IL-6 and IFN-γ in the serum and synovial tissue of model rats (± s，n ＝8，pg·mL－1)

表2 通痹膠囊對(duì)模型大鼠血清及滑膜組織中IL-6 和IFN-γ 含量的影響(± s，n ＝8，pg·mL－1)Tab 2 Effect of Tongbi capsule on the content of IL-6 and IFN-γ in the serum and synovial tissue of model rats (± s，n ＝8，pg·mL－1)

注（Note）：與正常組相比，▲▲P ＜0.01；與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the normal group，▲▲P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別 IL-6/（pg·mL－1） IFN-γ/（pg·mL－1）血清 滑膜組織 血清 滑膜組織正常組 112.73±14.17 90.75±14.03 1583.43±180.43 1341.85±185.75模型組 138.96±9.79▲▲ 126.57±13.82▲▲ 1921.94±196.62▲▲ 1936.91±159.07▲▲通痹膠囊低劑量 142.01±19.22 135.63±15.23 1901.99±232.69 1686.77±169.62**通痹膠囊中劑量 129.46±6.23* 114.22±6.45* 1658.26±156.28* 1456.63±176.71**通痹膠囊高劑量 114.88±15.85** 103.57±20.24* 1668.24±222.11* 1477.25±220.11**雷公藤多苷片 135.95±14.61 119.45±15.50 1825.02±73.26 1406.82±224.04**

3.3 對(duì)AA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 相對(duì)表達(dá)升高（P＜0.01）；通痹膠囊低、中、高劑量組及雷公藤多苷片組均能夠顯著降低AA 大鼠滑膜組織 中p-JAK2/JAK2 及p-STAT3/STAT3 相對(duì)表達(dá)（P＜0.01）。

4 討論

圖2 通痹膠囊對(duì)大鼠滑膜組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)的影響Fig 2 Effect of Tongbi capsule on protein expressions of joint synovial tissue p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3

JAK/STAT 途徑是多種細(xì)胞生長(zhǎng)、活化、分化、凋亡及其功能發(fā)揮過(guò)程中重要的一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已有研究證實(shí)，在RA 發(fā)病過(guò)程中JAK/STAT 信號(hào)通路處于激活狀態(tài)[1]。許多細(xì)胞因子能夠激活JAK/STAT 途徑，其中包括IL-6及IFN-γ[8]。IL-6 及IFN-γ的水平在RA 滑膜組織中顯著升高，其在RA 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這些細(xì)胞因子本身并無(wú)激酶活性[9]，但當(dāng)受體與相應(yīng)配體結(jié)合時(shí)，可使受體二聚體化，與酪氨酸蛋白激酶JAK 相結(jié)合、聚集，并使JAK活化，活化的JAK 使受體上酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，促使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT 蛋白與受體結(jié)合，并在JAK 的催化下發(fā)生磷酸化，磷酸化STAT 與受體親和力降低，與受體分離，并形成二聚體的活性形式轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，結(jié)合到DNA的特定反應(yīng)元件上誘導(dǎo)相應(yīng)靶基因的表達(dá)[10-13]。

JAK2 是JAK 激酶家族成員之一，廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中[14]，其在參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[15]，STAT3 是一個(gè)關(guān)鍵性RA 致病因子，能夠抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）凋亡、促進(jìn)T 細(xì)胞存活及抗體產(chǎn)生[16-17]，受促炎因子調(diào)控而失衡的STAT3 信號(hào)可導(dǎo)致慢性滑膜炎的產(chǎn)生[18]，抑制JAK2 及STAT3 的磷酸化對(duì)緩解關(guān)節(jié)炎癥狀、促進(jìn)FLS 凋亡意義重大[19-22]。在本研究中，AA 大鼠血清及滑膜組織中促炎因子IL-6、IFN-γ含量明顯升高，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 相對(duì)表達(dá)升高，經(jīng)通痹膠囊治療后，IL-6 及IFN-γ的含量下降，JAK、STAT 蛋白磷酸化得到抑制。

課題組前期研究表明，通痹膠囊能夠顯著降低大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及足腫脹度，有效降低大鼠血清及滑膜組織中IL-1 和TNF-α的含量，并抑制滑膜組織中p38MAPK、NF-κB 及IκBα的蛋白表達(dá)[3]。p38MAPK/NF-κB 信號(hào)通路與JAK2/STAT3信號(hào)通路在RA 的發(fā)病過(guò)程中，均處于激活狀態(tài)，活化的MAPKs、JAK/STAT 磷酸化它們的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子，與相應(yīng)基因的增強(qiáng)子結(jié)合后，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生炎性因子、趨化因子，造成滑膜細(xì)胞的增生及骨組織的破壞；炎性因子、趨化因子又能活化MAPKs、JAK/STAT 路徑，從而形成惡性循環(huán)，造成持久的慢性滑膜炎[5]。因此，對(duì)MAPKs 與JAK/STAT 通路的調(diào)控，將會(huì)對(duì)RA 的治療產(chǎn)生積極的作用。

RA 在中醫(yī)學(xué)中屬“痹癥”范疇，也稱(chēng)之為“頑痹”“久痹”“骨痹”“筋痹”“歷節(jié)”“鼓槌風(fēng)”“鶴膝風(fēng)”等，它的病理因素主要有風(fēng)、寒、濕等方面[23]，風(fēng)勝為行痹、寒勝為痛痹、濕勝為著痹[24]。風(fēng)寒濕邪、入侵筋脈、痹阻氣血、凝滯關(guān)節(jié)而成疼痛重著之癥，病及日久，損傷氣血，肝腎不足而成纏綿之勢(shì)。通痹膠囊能夠祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)，用于風(fēng)寒濕痹證。方中秦艽祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，香附為氣中之血藥，行血中之氣滯而止痛，共為君藥；羌活、獨(dú)活、制川烏祛風(fēng)濕，散寒凝，止痹痛，雞血藤、絡(luò)石藤、忍冬藤取“藤以入絡(luò)”能通行絡(luò)脈、經(jīng)筋以止痛，木瓜舒筋活絡(luò)，共為臣藥；桑寄生、杜仲、牛膝祛風(fēng)濕兼補(bǔ)肝腎，當(dāng)歸養(yǎng)血活血以驅(qū)邪，馬錢(qián)子加強(qiáng)止痛之功，共為佐藥；金錢(qián)白花蛇透骨搜風(fēng)，引藥入絡(luò)，能更好地發(fā)揮藥力。中藥復(fù)方具有多成分共同起效治療疾病的特點(diǎn)，一般涉及多通路多靶點(diǎn)，對(duì)其作用機(jī)制的研究仍需更加深入。