付偉，楊群，薄雯映，沈華*（1.湖北金貴中藥飲片有限公司，武漢 430051；.九州通醫(yī)藥集團(tuán) 九信（武漢）中藥研究院有限公司，武漢 430050）

天麻為蘭科屬植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖，是我國傳統(tǒng)珍貴藥材之一，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽和祛風(fēng)通絡(luò)的作用，常用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木和風(fēng)濕痹痛等癥[1]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[2]，其炮制方法最早記載于《雷公炮炙論》[3]：“修事天麻十兩，焙之，細(xì)剉，單搗然用”。2020年版《中國藥典》[1]收載的天麻，其飲片【炮制】項(xiàng)下規(guī)定天麻的加工方式為采挖，清洗，蒸透，干燥，潤透，切片，干燥。該方法操作復(fù)雜，過程重復(fù)，耗時(shí)費(fèi)力，有效成分損失較大，制成的飲片質(zhì)地堅(jiān)硬，易變色，且氣味特異或有酸味，嚼之有黏性，需蒸煮服用，食用不便，采用真空冷凍干燥方法處理可以有效地解決上述問題。真空冷凍干燥方法的加工過程為將采挖的鮮藥材洗凈后直接放入低溫下冷凍，當(dāng)樣品完全冷凍后抽真空，低溫干燥。由于整個(gè)過程都是在低溫條件下進(jìn)行，能夠較好地保留藥材的外觀品質(zhì)、顏色、氣味，同時(shí)使有效成分保留率高，溶出速度快，開袋即食，使用方便，具有較好的發(fā)展前景[4-7]。大量試驗(yàn)表明，預(yù)凍時(shí)間、預(yù)凍溫度、干燥溫度、一次干燥時(shí)間等因素均可影響凍干樣品的質(zhì)量[8-11]。本試驗(yàn)擬用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)方法，以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇及巴利森苷類含量的綜合評分作為指標(biāo)，考察預(yù)冷凍時(shí)間、干燥溫度、一次干燥時(shí)間3 個(gè)因素對天麻真空冷凍干燥工藝的影響，優(yōu)選天麻凍干工藝。

1 材料

1.1 試藥

天麻素（批號：110807-201809，純度：96.7%）、對羥基苯甲醇（批號：111970-201702，純度：99.4%）（中國食品藥品檢定研究院）；巴利森苷A（批號：PS011129，含量＞98.0%）、巴利森苷B（批號：PS011138，含量＞98.0%）、巴利森苷C（批號：PS011140，含量＞98.0%）、巴利森苷E（批號：PS190918-01，含量≥98.0%）（成都普斯生物科技股份有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜級，乙醇、磷酸均為分析級，水為超純水。

鮮天麻由金寨九州天潤中藥產(chǎn)業(yè)有限公司提供，經(jīng)九信（武漢）中藥研究院有限公司吳衛(wèi)剛高級工程師鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖。

1.2 儀器

LGJ-10E 型冷凍干燥機(jī)[四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司]；1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UPT-11-10T 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)指標(biāo)成分的測定

2.1.1 浸出物測定 天麻浸出物的測定方法參照2020年版《中國藥典》通則2201 項(xiàng)下熱浸法測定[12]，浸出物溶劑為稀乙醇。

2.1.2 含量測定 天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E指標(biāo)成分的測定方法參照2020年版《中國藥典》天麻項(xiàng)下特征圖譜的方法測定[1]，天麻樣品與混合對照品的HPLC 對比鏡像圖見圖1。

圖1 天麻樣品與混合對照品HPLC 鏡像圖Fig 1 HPLC mirror image of Gastrodiae Rhizoma sample and mixed reference substance

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)選天麻冷凍真空干燥工藝

根據(jù)前期試驗(yàn)，選擇預(yù)凍時(shí)間（A）、干燥溫度（B）和一次干燥時(shí)間（C）3 個(gè)因素為響應(yīng)面法考察因素，以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇含量及巴利森苷類含量的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單因素的最佳值為中心，上下區(qū)域各給定1 個(gè)水平值，該3 個(gè)值作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平，設(shè)計(jì)3 因素3 水平17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。試驗(yàn)結(jié)果采用 Design-Expert 11 軟件進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化天麻的真空冷凍干燥工藝。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中的因素及水平Tab 1 Factors and levels of the Box-Behnken design

3 結(jié)果與分析

3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

由于響應(yīng)面試驗(yàn)使用的評價(jià)指標(biāo)數(shù)量較多，為盡可能客觀地反映各個(gè)因素之間的關(guān)系及各個(gè)因素水平對天麻真空冷凍干燥工藝的影響，擬采用綜合加權(quán)評分法，將各個(gè)指標(biāo)以一個(gè)綜合指標(biāo)（OD）的形式綜合考察，以綜合指標(biāo)進(jìn)行直觀分析。根據(jù)各指標(biāo)成分的重要性，確定浸出物（x1）與對羥基苯甲醇（x3）的權(quán)重系數(shù)均為0.1，天麻素（x2）的權(quán)重系數(shù)為0.3。巴利森苷類（x4）由于成分較多，權(quán)重系數(shù)為0.5。綜合評分（OD）＝0.1x1/x1max＋0.3x2/x2max＋0.1x3/x3max＋0.5x4/x4max。Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 11 軟件對結(jié)果進(jìn)行模型擬合，擬合分析結(jié)果見表3，由結(jié)果可知該模型適合采用二次方程。以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量的綜合評分為響應(yīng)值，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可以用回歸方程表示為：Y1＝0.8556 ＋0.0148A＋0.0648B＋0.0448C＋0.0443AB－0.0862AC＋0.0158BC－0.1402A2－0.0267B2－0.0427C2。方差分析結(jié)果見表4。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab 2 Design and data of the Box-Behnken test

表3 多種模型擬合分析Tab 3 Multiple model fitting analysis

由表4可知，回歸方程使用的模型P＜0.0001，表明此模型有效可靠。失擬項(xiàng)是用來表示模型與試驗(yàn)擬合的程度，本次模型的失擬項(xiàng)P值為0.0706＞0.05，表明該模型無失擬因素存在，模型與實(shí)際值能較好地?cái)M合。R2＝0.9909，說明該模型能解釋99.09%響應(yīng)值的變化；R2Adj＝0.9792，說明可信度較好，可以運(yùn)用該模型分析。

該模型中，干燥溫度（B）、干燥時(shí)間（C）、預(yù)凍時(shí)間-干燥時(shí)間（AB）、預(yù)凍時(shí)間-干燥溫度（AC）、A2、C2極顯著；干燥溫度-干燥時(shí)間（BC）、預(yù)凍時(shí)間（A）、B2顯著；說明在綜合評分作為評價(jià)指標(biāo)的情況下，各影響因素之間不僅存在線性關(guān)系，還存在交互影響。不同考察因素與綜合評分的響應(yīng)面分析見圖2～4。圖2及圖3的響應(yīng)面圖坡度較陡，表明預(yù)凍時(shí)間與干燥時(shí)間、預(yù)凍時(shí)間與干燥溫度交互作用較強(qiáng)，對綜合評分的影響顯著。圖4的響應(yīng)面圖坡度平緩，表明干燥時(shí)間與干燥溫度的交互作用較弱，對綜合評分的影響較小。

根據(jù) Design-Expert 11.0 軟件計(jì)算結(jié)果分析可知，天麻凍干的最佳工藝為預(yù)凍時(shí)間10 h，干燥時(shí)間18 h，干燥溫度47.2℃，理論計(jì)算得分為0.915，為方便試驗(yàn)操作，將最佳工藝調(diào)整為冷凍10 h，在溫度45℃條件下干燥 18 h。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis in regression model

圖2 預(yù)凍時(shí)間和一次干燥時(shí)間及其交互作用對綜合評分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 2 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and primary drying time

圖3 預(yù)凍時(shí)間和干燥溫度及其交互作用對綜合評分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 3 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and drying temperature

通過Box-Behnken 試驗(yàn)確定天麻凍干的最佳工藝為冷凍 10 h，在溫度45℃條件下干燥 18 h，在此凍干條件下，預(yù)估天麻的浸出物含量為35.0%，天麻素含量為0.44%，對羥基苯甲醇含量為 0.02%，巴利森苷類含量為 3.58%。稱取天麻鮮品 3 份，每份 700 g，按照最優(yōu)的工藝制備樣品，測定其含量，驗(yàn)證凍干工藝的可行性。結(jié)果顯示天麻浸出物的含量平均為34%，天麻素的含量平均為0.45%，對羥基苯甲醇的含量平均為0.03%，巴利森苷類的含量平均為3.57%，與預(yù)估值基本一致。說明該回歸模型可信度高，預(yù)測效果較好，具有可重復(fù)性和可操作性，可用于天麻凍干飲片制備。

圖4 干燥溫度和一次干燥時(shí)間及其交互作用對綜合評分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 4 3D response surface plot and contour plot of drying temperature and primary drying time

4 討論

天麻素、對羥基苯甲醇為天麻的主要有效成分，具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠、降壓等作用[13-18]。2020年版《中國藥典》將天麻素與對羥基苯甲醇含量之和列為控制指標(biāo)，評價(jià)天麻的質(zhì)量。研究表明[19-22]，天麻中亦含有大量的巴利森苷類化合物，該類化合物可以明顯改善大腦的學(xué)習(xí)記憶，具有抗抑郁、抗衰老等藥理作用，是天麻的重要成分。為了更有效、客觀地評價(jià)各因素對真空冷凍干燥工藝條件的影響，本文以浸出物、天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷 E 的含量作為優(yōu)化天麻真空冷凍干燥工藝的評價(jià)指標(biāo)。

通過前期試驗(yàn)確定預(yù)凍時(shí)間、干燥時(shí)間和干燥溫度3 因素對天麻質(zhì)量影響較大，故選擇該3個(gè)因素作為Box-Behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素，確定天麻的最佳真空冷凍干燥工藝條件為：預(yù)凍時(shí)間 10 h，干燥溫度45 ℃，干燥時(shí)間 18 h。凍干工藝得到的天麻產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以有效防止藥效成分在干燥過程中被分解，同時(shí)最大限度地保留了產(chǎn)品原有的色、香、味，而且在生產(chǎn)過程中沒有添加任何防腐劑，保證了產(chǎn)品的食用安全性，極大地提高了產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。

由于凍干天麻含水量低，在高濕條件下易吸潮變色，不易保存，故對包裝要求比較高，前期摸索發(fā)現(xiàn)鋁箔材質(zhì)及低溫條件下可以較好地防止凍干天麻吸水受潮，后期將會(huì)開展凍干天麻的儲(chǔ)藏期試驗(yàn)，擬尋找凍干天麻的最適包裝及最佳儲(chǔ)存條件，為凍干天麻工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。