茹 剛，陳學(xué)林，于文惠，張?zhí)姨?/p>

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

伏毛鐵棒錘(AconitumflavumHand.-Mazz.)為毛茛科烏頭屬多年生草本植物，又名斷腸草、一枝蒿等，生長(zhǎng)在海拔2 000～3 700 m山地草坡或疏林下，主要分布于甘肅、青海及寧夏南部等。伏毛鐵棒錘是藏族習(xí)用地道藥材，收錄于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)》(第一冊(cè))[1]。其塊根有劇毒，加工后可供藥用，主治跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛等癥。其藥用價(jià)值很高，對(duì)腫瘤也有一定療效，有很好的鎮(zhèn)痛作用，比嗎啡藥效強(qiáng)約50倍并不具成癮性[2]。目前伏毛鐵棒錘的使用價(jià)值不僅體現(xiàn)在醫(yī)療領(lǐng)域，其有效成分生物堿還是殺蟲劑的重要組分，張玉粉[3]探究了伏毛鐵棒錘生物堿對(duì)化學(xué)農(nóng)藥毒殺力度的影響，結(jié)果顯示伏毛鐵棒錘生物堿和高效氯氟氰菊酯(betacyfluthrin)混配表現(xiàn)出較強(qiáng)的增效作用。此外，伏毛鐵棒錘花序長(zhǎng)而豐滿，呈紫色或暗紫色，花期為8-9月，具有較高的園林觀賞價(jià)值。

低溫是限制植物種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的非生物脅迫因子之一，低溫不僅會(huì)引起植物莖葉形態(tài)的改變，還會(huì)使植株的正常新陳代謝紊亂，低溫超過(guò)耐受范圍甚至?xí)斐芍参矬w的死亡[4]。我國(guó)大面積早春凍害(又稱倒春寒)時(shí)有發(fā)生。據(jù)白城市氣象站23年的氣象記錄，4月上中旬地面氣溫低于-10 ℃的概率為22%，可見發(fā)生“倒春寒”的概率很高；2001年呼倫貝爾曾有4 000 hm2的紫花苜蓿由于受到寒流的侵襲導(dǎo)致大面積死亡，給當(dāng)?shù)啬撩竦慕?jīng)濟(jì)收入造成了巨大損失[5]。在我國(guó)北方地區(qū)，伏毛鐵棒錘幼苗也常受到低溫的脅迫，所以提高伏毛鐵棒錘幼苗的抗寒性勢(shì)在必行。

目前，有關(guān)外源NO對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)和幼苗生理學(xué)特性的影響鮮有報(bào)道。為此，本研究以伏毛鐵棒錘種子和幼苗為材料，探討外源NO對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗膜系統(tǒng)穩(wěn)定性、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及葉綠素含量的影響，旨在豐富外源NO對(duì)逆境脅迫下藥用植物影響的理論研究，為提高伏毛鐵棒錘幼苗的抗寒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用種子于2018年9月采自甘肅省景泰縣老爺廟(103°49′19″ N,37°04′02″ E)，由陳學(xué)林教授鑒定為伏毛鐵棒錘種子。伏毛鐵棒錘種子在4 ℃下濕砂層積40 d破除休眠后，在SPX-150-GB型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)萌發(fā)。外源NO供體硝普鈉(SNP)購(gòu)自天津市北辰方正試劑廠。

1.2 方 法

1.2.1 低溫脅迫下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)的測(cè)定 取大小均勻、飽滿干燥的伏毛鐵棒錘種子(50粒為1組)，在外源NO供體硝普鈉(SNP)濃度分別為0(對(duì)照,CK)，50，100，150，200，250，300 μmol/L的溶液中浸種24 h，每組處理3個(gè)重復(fù)。24 h后將種子置于覆有雙層濾紙直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，以伏毛鐵棒錘種子最佳萌發(fā)溫度15 ℃為對(duì)照[9]，分別在8，4 ℃下置于SPX-150-GB型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)萌發(fā)(光強(qiáng)：4 000 lx，相對(duì)濕度：85%，光周期：10 h黑暗/14 h光照)。并定時(shí)向培養(yǎng)皿中加對(duì)應(yīng)溶液以確保濾紙濕潤(rùn)，隨時(shí)觀察種子萌發(fā)情況，以胚芽生長(zhǎng)長(zhǎng)度為種子長(zhǎng)度的1/2為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。參照劉維寶等[10]的方法，在第1粒種子萌發(fā)后每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，測(cè)量根長(zhǎng)并計(jì)算活力指數(shù)。

萌發(fā)率=第30天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

萌發(fā)勢(shì)=第18天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

活力指數(shù)=∑Gt/Dt×Ls。其中，Dt為相應(yīng)發(fā)芽時(shí)間，Gt為Dt時(shí)間內(nèi)的出芽種子數(shù)，Ls為根長(zhǎng)。

1.2.2 伏毛鐵棒錘幼苗的培養(yǎng)及處理 由于4 ℃低溫下伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)率較低，出苗率達(dá)不到后續(xù)試驗(yàn)所需，故選擇15 ℃下培養(yǎng)的伏毛鐵棒錘幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)出2片真葉后，在其葉面定時(shí)噴施50，100，150，200，250，300 μmol/L SNP溶液，每天1次，以蒸餾水處理為對(duì)照。3 d后將處理幼苗置于4 ℃ SPX-150-GB型光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)，每隔24 h測(cè)定幼苗相關(guān)生理指標(biāo)，連續(xù)測(cè)3 d。第三天后，測(cè)定4 ℃脅迫未經(jīng)緩解及4 ℃脅迫后經(jīng)200 μmol/L SNP緩解過(guò)的伏毛鐵棒錘幼苗的葉綠素(a+b)含量，并觀察其表型特征，以上述15 ℃培養(yǎng)的伏毛鐵棒錘幼苗為對(duì)照。

1.2.3 伏毛鐵棒錘幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用程艷等[11]的方法；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用2-硫代巴比妥酸法[12]；過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定參照賽鬧汪青等[13]的方法；可溶性糖含量測(cè)定采用苯酚法[14]；游離脯氨酸含量測(cè)定參照李合生[15]的方法；葉綠素(a+b)含量測(cè)定按照張伏等[16]的方法。各指標(biāo)均以葉片鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0和Orign 8.50軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)的影響

SNP對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)的影響見圖1和圖2。

標(biāo)不同小寫字母表示同一溫度下不同處理間在P<0.05水平上有顯著性差異；不同大寫字母表示同一處理下不同溫度間在P<0.05水平上有顯著性差異。圖2同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at same temperature at P<0.05 level,and different uppercase letters indicate significant differences in same treatment at different temperatures at P<0.05 level.The same as Fig.2圖1 SNP對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)的影響Fig.1 Effects of SNP on seed germination rate and germination potential of Aconitum flavum Hand.-Mazz under low temperature stress

由圖1和圖2可看出，經(jīng)破除休眠的伏毛鐵棒錘種子，其萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)均對(duì)溫度較為敏感。與15 ℃相比，8 和4 ℃低溫下各處理組伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)均顯著下降(P<0.05)。在8和4 ℃條件下，隨著SNP溶液濃度增大，伏毛鐵棒錘種子的萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均在SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)達(dá)到最高；與未添加SNP組相比，8 ℃下200 μmol/L SNP處理種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)分別提高了16.0%，9.8%，14.0%；4 ℃下分別提高了10.4%，9.3%，11.0%。結(jié)果表明，200 μmol/L SNP溶液處理有效緩解了低溫脅迫對(duì)伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)的影響。15 ℃下，當(dāng)SNP溶液濃度小于200 μmol/L時(shí)，各處理種子的萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)間差異均不顯著(P>0.05)；8和4 ℃下隨著SNP溶液濃度增大，各處理種子的萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)相比對(duì)照均顯著提高(P<0.05)。當(dāng)SNP溶液濃度高于200 μmol/L時(shí)，15，8和4 ℃下種子萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)均顯著下降，這可能是高濃度NO分子作為自由基對(duì)種子萌發(fā)造成了一定的毒害。

圖2 SNP對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘種子萌發(fā)活力指數(shù)的影響Fig.2 Effects of SNP on seed germination vitality index of Aconitum flavum Hand.-Mazz under low temperature stress

2.2 SNP對(duì)低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗生理特性的影響

2.2.1 對(duì)SOD、POD、CAT活性的影響 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗SOD、POD、CAT活性的影響見圖3和圖4。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示同時(shí)間下不同處理間在P<0.05水平有顯著性差異。下圖同Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at same time at the P<0.05 level. The same below圖3 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗SOD、POD活性的影響Fig.3 Effects of SNP on SOD and POD activities of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

由圖3和圖4可知，4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)SOD、POD、CAT活性持續(xù)上升；而同時(shí)段不同濃度SNP處理SOD、POD、CAT活性均隨著SNP處理濃度的增加，呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)，SOD、POD、CAT活性均達(dá)到最高，此時(shí)SOD活性在24，48，72 h時(shí)間段內(nèi)分別較對(duì)照顯著提高了354.61%，335.11%和309.72%，POD活性分別顯著提高了77.78%，560.00%和583.33%，CAT活性分別顯著提高了189.64%，265.44%和446.01%。結(jié)果表明，適宜濃度SNP溶液可提高低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗的抗氧化酶活性。

圖4 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗CAT活性的影響Fig.4 Effects of SNP on CAT activities of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

2.2.2 對(duì)MDA含量的影響 由圖5可知，在4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)MDA含量均持續(xù)增加；而同時(shí)段不同SNP處理幼苗體內(nèi)MDA含量隨著SNP處理濃度的增加，呈先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)，MDA含量顯著降低，此時(shí)24，48，72 h時(shí)段分別較對(duì)照降低171.55%，131.17%，187.71%。當(dāng)SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時(shí)，MDA含量又持續(xù)上升。可見SNP溶液處理濃度過(guò)高不利于伏毛鐵棒錘幼苗的生長(zhǎng)。

圖5 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗MDA含量的影響 圖6 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗H2O2含量的影響Fig.5 Effect of SNP on MDA content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃ Fig.6 Effect of SNP on H2O2 content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

2.2.3 對(duì)H2O2含量的影響 由圖6可見，4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)H2O2含量均持續(xù)增加；而同時(shí)段不同SNP處理幼苗體內(nèi)H2O2含量隨著SNP處理濃度的增加呈先降低后升高趨勢(shì)。與對(duì)照相比，當(dāng)SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)，H2O2含量顯著降低，24，48，72 h分別較對(duì)照降低114.45%，67.10%，70.21%；當(dāng)SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時(shí)，H2O2含量又持續(xù)上升。表明適宜濃度SNP有效減少了伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)H2O2含量，從而保護(hù)了幼苗免受H2O2等ROS的毒害作用。

2.2.4 對(duì)可溶性糖和游離脯氨酸含量的影響 SNP對(duì)4 ℃低溫脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量的影響如圖7所示。

圖7 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.7 Effect of SNP on content of osmotic adjustment substance of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

由圖7可知，4 ℃低溫脅迫下，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量總體呈持續(xù)增加；而同時(shí)段不同SNP處理幼苗體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量均隨SNP處理濃度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量均達(dá)最大值，24，48，72 h可溶性糖含量分別較對(duì)照增加了239.53%，205.45%，154.17%；游離脯氨酸含量分別較對(duì)照增加了170.16%，182.53%，229.57%。當(dāng)SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時(shí)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量又持續(xù)下降。結(jié)果表明，200 μmol/L的SNP有效促進(jìn)了可溶性糖和游離脯氨酸含量的積累，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)穩(wěn)定了細(xì)胞水勢(shì)和膨壓，避免伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，從而緩解了逆境脅迫對(duì)幼苗造成的傷害。

2.2.5 對(duì)葉綠素(a+b)含量的影響 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)含量的影響見圖8。由圖8可知，4 ℃低溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)葉綠素(a+b)含量持續(xù)下降；而同時(shí)段不同SNP處理伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)葉綠素(a+b)含量隨著SNP處理濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)，不同低溫脅迫時(shí)段伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)葉綠素(a+b)含量均達(dá)到峰值，24，48，72 h分別較對(duì)照增加82.35%，92.31%，111.11%；當(dāng)SNP溶液處理濃度高于200 μmol/L時(shí)，葉綠素(a+b)含量又逐漸下降。表明適宜濃度的SNP可緩解低溫對(duì)伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素合成的影響。

圖8 SNP對(duì)4 ℃下伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)含量的影響Fig.8 Effects of SNP on chlorophyll (a+b) content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

3組不同處理伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素 (a+b)含量見表1。由表1可知，4 ℃脅迫未經(jīng)緩解的幼苗葉綠素(a+b)含量較對(duì)照降低86.76%(P<0.05)；而4 ℃脅迫經(jīng)200 μmol/L SNP緩解過(guò)的幼苗較對(duì)照降低77.20%，且較未經(jīng)緩解組顯著提高72.22%。從圖9也可以看出，與15 ℃下對(duì)照組幼苗相比，4 ℃脅迫后用200 μmol/L SNP緩解過(guò)的伏毛鐵棒錘幼苗葉片顏色泛黃，而4 ℃脅迫未經(jīng)緩解組幼苗表現(xiàn)更甚。這種表型特征與葉綠素(a+b)含量變化趨勢(shì)完全吻合，表明SNP有效促進(jìn)了低溫脅迫下光合色素含量的積累。

圖9 SNP對(duì)4 ℃脅迫下伏毛鐵棒錘幼苗表型特征的影響Fig.9 Effects of SNP on phenotype characteristics of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings at 4 ℃

表1 不同處理對(duì)伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)含量的影響Table 1 Effects of different treatments on chlorophyll (a+b) content of Aconitum flavum Hand.-Mazz seedlings

3 討 論

低溫是植物的環(huán)境脅迫因子之一，影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，降低產(chǎn)量，影響品質(zhì)，給種植戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照15 ℃相比，8和4 ℃低溫處理下伏毛鐵棒錘種子的萌發(fā)率，萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)均顯著降低；但施加SNP溶液后，伏毛鐵棒錘種子的萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)及活力指數(shù)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且均在200 μmol/L SNP下達(dá)到最大值。表明適宜濃度的外源NO可有效提高伏毛鐵棒錘種子的低溫耐受性。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的必要色素，低溫可導(dǎo)致葉綠體變形，使葉綠素和類胡蘿卜素含量下降，同時(shí)低溫使光合酶活性和光合電子傳遞速率受到抑制[24]。于秀針等[25]研究發(fā)現(xiàn)，100～1 000 μmol/L SNP溶液均能提高番茄幼苗葉片的葉綠素及脯氨酸含量。杜曉等[26]研究指出，可溶性糖不僅是植物體進(jìn)行新陳代謝所需能量的主要原料物質(zhì)，而且對(duì)植物體應(yīng)對(duì)逆境脅迫起到滲透調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，SNP溶液濃度為200 μmol/L時(shí)，伏毛鐵棒錘幼苗葉綠素(a+b)、可溶性糖及游離脯氨酸含量顯著提高。葉綠素(a+b)含量提高使得伏毛鐵棒錘幼苗能正常進(jìn)行光合作用，可溶性糖和游離脯氨酸含量增加能夠穩(wěn)定細(xì)胞水勢(shì)和膨壓，進(jìn)而降低細(xì)胞冰點(diǎn)，避免伏毛鐵棒錘幼苗體內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能遭受破壞。

4 結(jié) 論

施加適宜濃度的外源NO(SNP溶液)可提高伏毛鐵棒錘種子對(duì)低溫的耐受性；SNP溶液最佳濃度為200 μmol/L；伏毛鐵棒錘幼苗可通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)清除由低溫脅迫積累的過(guò)?；钚匝醯扔泻ξ镔|(zhì)；通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量降低細(xì)胞冰點(diǎn)，進(jìn)而減少細(xì)胞結(jié)冰，避免體內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能遭受破壞。