高 茜 趙紅霞 李忠春 孟憲良

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、反復(fù)發(fā)作性短暫功能失調(diào)綜合征，其人群患病率僅次于腦卒中[1]。多數(shù)患者的病情經(jīng)藥物治療后基本可得到控制，但仍有約20%的患者長期反復(fù)發(fā)作[2-3]。因此，研發(fā)有效的抗癲癇治療藥物具有重要臨床意義[4]。微核糖核酸(microRNA，miRNA)為長度在19～25個核苷酸之間的短鏈、非編碼、內(nèi)源性小RNA，其可靶向結(jié)合mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)序列，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性和翻譯效率[5]。Simonato等[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA參與的調(diào)控機(jī)制在癲癇疾病的防治中扮演重要角色。癲癇患者腦內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)活躍，癲癇發(fā)作時自由基(free radical，F(xiàn)R)含量顯著增加，遠(yuǎn)超過機(jī)體對FR的清除能力。大量的FR可以直接使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸(DNA)等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，從而破壞細(xì)胞膜和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)。當(dāng)腦組織受到FR和內(nèi)源性毒素等攻擊時，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(nuclear transcription-related factor 2，Nrf2)與其特異性受體KELCH樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap-1)解除偶聯(lián)，半衰期明顯延長，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合后誘導(dǎo)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)。因此，考慮癲癇發(fā)生的相關(guān)機(jī)制可能與Nrf2-ARE信號通路的激活相關(guān)。本研究旨在探討miRNA-221在小鼠癲癇神經(jīng)元模型中的調(diào)節(jié)作用及其對上述信號通路的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與試劑 小鼠神經(jīng)元細(xì)胞株購自上海康朗公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。miRNA抽提試劑盒、人谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)印跡膜、電化學(xué)(ECL)發(fā)光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白質(zhì)裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。大鼠抗小鼠bcl-2、大鼠抗小鼠Bax、大鼠抗小鼠裂解的半胱天冬酶3(cleaved-Caspase3)、兔抗小鼠血紅素氧化酶1(HO-1)、兔抗小鼠Nrf2多克隆抗體亦購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經(jīng)元癲癇模型的建立與分組 參照Sombati等[7]的方法建立并改良癲癇神經(jīng)元細(xì)胞株模型。小鼠神經(jīng)元細(xì)胞株在維持培養(yǎng)液(Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)液，2% B-27、1% 0.5 mmol/LL-谷氨酰胺、1%青霉素+鏈霉素)中培養(yǎng)14 d后，棄去維持培養(yǎng)液，隨機(jī)分配至正常對照組、 miRNA陰性對照(miRNA-con)組和miRNA-221 mimic轉(zhuǎn)染(miRNA-221)組，每組各12例樣本，予如下處理。①正常對照組：在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，置于維持培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)(時間同步其他兩組)，用于后續(xù)試驗。②miRNA-con組：將維持培養(yǎng)液更換為無鎂細(xì)胞培養(yǎng)液[145 g氯化鈉、2.5 g氯化鉀、10 g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液、2 g氯化鈣、10 g葡萄糖、0.002 g甘氨酸，溶于1 000 mL無菌水，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至 7.2]，即建立癲癇模型。培養(yǎng)3 h，以無血清正常細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2遍，加入正常維持液培養(yǎng)液(每孔2 mL)，待細(xì)胞生長至50%融合面積(第14～21天)，使用DNA-lipo2000脂質(zhì)體復(fù)合物(1 μg DNA∶1 μL脂質(zhì)體)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，每孔加入含20%胎牛血清+杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的轉(zhuǎn)染液1 mL，37 ℃培養(yǎng)48 h，用G418篩選培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，每3～4 d更換篩選培養(yǎng)液，7 d后參照細(xì)胞克隆篩選法篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于后續(xù)試驗。③miRNA-221組的mimic試劑轉(zhuǎn)染比例和轉(zhuǎn)染步驟同miRNA-con組。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR實驗 應(yīng)用miRNA抽提試劑盒提取小鼠神經(jīng)元細(xì)胞株miRNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作方法，采用莖環(huán)法合成模板鏈cDNA。并按照實時熒光定量RT-PCR試劑盒說明書要求的反應(yīng)體系進(jìn)行目的基因的PCR定量，每個樣品重復(fù)3次，取平均值，以2-△△Ct法計算各組miRNA-221的相對表達(dá)水平。

1.2.3 ELISA實驗 按照GSH檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒說明書要求測定3組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞株的GSH、MDA含量。

1.2.4 免疫印跡實驗 采用RIPA蛋白質(zhì)裂解液對3組樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解1 h，冰上操作；以BCA法檢測提取的總蛋白質(zhì)濃度。按比例在各樣本中加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水中變性5 min，離心后取上清液60 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉各樣本的PVDF膜1 h后，以1×TBST(Tris-鹽酸、氯化鈉和Tween 20)洗滌；4 ℃條件下，將PVDF膜浸入1∶1 000稀釋的一抗中孵育過夜；孵育完成后以封閉液洗膜3次，每次5 min，后于37 ℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入1∶2 000稀釋的二抗中孵育2 h。按照ECL試劑盒說明書要求進(jìn)行顯影曝光。應(yīng)用Image J系統(tǒng)分析目的條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、HO-1和Nrf2的表達(dá)水平。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測 采用結(jié)合緩沖液500 μL懸浮3組神經(jīng)元細(xì)胞株，分別加入5 μL的 Annexin V、 FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定并分析結(jié)果。細(xì)胞總凋亡率(%)=早期細(xì)胞凋亡率(%)+晚期細(xì)胞凋亡率(%)。每個樣本重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-221過表達(dá)效率 miRNA-con組的miRNA-221表達(dá)水平(0.95±0.12)顯著低于miRNA-221組(3.14±0.25,F=168.190，P<0.05)。

2.2 miRNA-221對細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 miRNA-con組細(xì)胞的GSH表達(dá)水平(96.27±12.20)顯著低于miRNA-221組(162.65±19.53，F(xiàn)=168.190，P<0.05)；miRNA-con組細(xì)胞的MDA表達(dá)水平(97.46±10.19)顯著高于miRNA-221組(58.66±8.81，F(xiàn)=19.352，P<0.05)。

2.3 miRNA-221對細(xì)胞凋亡的影響 miRNA-con組細(xì)胞的凋亡率為(16.34±1.20)%，顯著高于miRNA-221組[(8.75±1.53)%,F=27.115，P<0.05]，與正常對照組(15.71±1.46)%的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與miRNA-con組相比，miRNA-221組細(xì)胞中抗凋亡蛋白質(zhì)bcl-2表達(dá)水平顯著升高，促凋亡蛋白質(zhì)Bax和cleaved-Caspase3表達(dá)水平顯著降低(P值均<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠癲癇神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較

2.4 miRNA-221對細(xì)胞Nrf2信號通路的影響 miRNA-con組細(xì)胞中HO-1、Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著低于miRNA-221組(P值均<0.01)。見圖1、表2。

1 正常對照組 2 miRNA-con組 3 miRNA-221組圖1 小鼠癲癇神經(jīng)元細(xì)胞Nrf2信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)

表2 各組小鼠癲癇神經(jīng)元細(xì)胞Nrf2信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平比較

3 討 論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。研究[6,8-9]發(fā)現(xiàn)，miRNA參與對癲癇的調(diào)控，但相關(guān)分子機(jī)制仍未明確。Ren等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-181a的表達(dá)水平與癲癇持續(xù)的時間呈正相關(guān)，miRNA-181a拮抗劑可抑制Caspase3蛋白質(zhì)的表達(dá)，減少癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，對癲癇神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。Kan等[11]發(fā)現(xiàn)，miRNA-221和miRNA-222可靶向調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)。研究[12]結(jié)果顯示，miRNA-221可結(jié)合Nrf2及其下游相關(guān)基因的啟動子片段;故本研究選擇該miRNA作為干預(yù)靶點。本研究結(jié)果顯示，與miR-221組相比，miRNA-con組中miRNA-221的表達(dá)水平較低；結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測、免疫印跡實驗結(jié)果證實，過表達(dá)miRNA-221可抑制該神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

在本研究中，過表達(dá)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞株miRNA-221后，該細(xì)胞株HO-1、Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均上調(diào)，細(xì)胞GSH的表達(dá)上調(diào)，MDA的含量下調(diào)；故過表達(dá)miRNA-221可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力。研究[13]發(fā)現(xiàn)，Nrf2可激活人類基因組中超過500個基因的轉(zhuǎn)錄，且大多數(shù)基因具有細(xì)胞保護(hù)功能。結(jié)合本研究結(jié)果推測，Nrf2通過影響多種基因的轉(zhuǎn)錄，有效協(xié)調(diào)和激活了細(xì)胞的抗氧化活性，并強(qiáng)化抗炎癥反應(yīng)作用，從而刺激線粒體生物發(fā)生，改善線粒體功能，激活自噬機(jī)制，清除有毒蛋白質(zhì)聚集物和功能失調(diào)的細(xì)胞器[14-15]。有研究[16-17]報道，人體或模型動物中Nrf2高水平表達(dá)可有效抑制機(jī)體因慢性炎癥反應(yīng)誘發(fā)的相關(guān)疾病，包括各種心血管疾病、腎病、肺病、中毒性肝損傷、癌癥、糖尿病、代謝綜合征、肥胖、敗血癥、自身免疫性疾病、炎癥性腸病、獲得性免疫缺陷綜合征和癲癇等。研究[18]結(jié)果表明，Nrf2與ARE結(jié)合，在氧化應(yīng)激條件下誘導(dǎo)抗氧化劑和Ⅱ相解毒酶上調(diào)，從而抑制氧化損傷和毒性代謝物的累積。當(dāng)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生超過細(xì)胞降解能力時，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[18]，損害細(xì)胞成分(包括脂質(zhì))，致使細(xì)胞生理功能下降和細(xì)胞死亡[19]。Wang等[20]研究結(jié)果證實，激活Nrf2信號通路與蘿卜硫素抑制小鼠杏仁核的點燃相關(guān)，且可改善癲癇發(fā)作引起的認(rèn)知障礙和氧化應(yīng)激。筆者分析認(rèn)為，Nrf2信號通路可能是癲癇治療的重要靶點。凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)是引發(fā)癲癇的主要病理機(jī)制，3個反應(yīng)作為一個環(huán)路相互影響、相互促進(jìn)，誘導(dǎo)癲癇的發(fā)生。

長鏈非編碼RNA-尿路上皮癌胚抗原1(long non-coding RNA-urothelial carcinoembryonic antigen 1，lncRNA-UCA1)和Nrf2在癲癇樣海馬組織和神經(jīng)元中表達(dá)均下調(diào)，而miRNA-221表達(dá)上調(diào)；且過表達(dá)的lncRNA-UCA1可負(fù)向調(diào)控miRNA-221對海馬神經(jīng)元凋亡的抑制，miRNA-221則可負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2[21-22]。在體內(nèi)和體外實驗中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(retinoblastoma l，Rb1)可增強(qiáng)細(xì)胞Nrf2和HO-1表達(dá)，使bcl-2表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)下調(diào)，提示Rb1可通過激活Nrf2信號通路對戊四唑誘導(dǎo)的腦損傷和Mg2 +誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，miRNA-221可減輕氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)導(dǎo)致的小鼠癲癇神經(jīng)元細(xì)胞損傷，為癲癇的治療提供新靶點。