楊云龍，汪建中

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤，其中大部分為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，約占肺癌患者的85%，NSCLC主要分為鱗癌、腺癌和大細胞癌3個病理類型[1].近年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，探尋有效的預(yù)測療效的生物學(xué)標(biāo)志是實現(xiàn)個性化治療的關(guān)鍵，對NSCLC患者的診斷、預(yù)后具有重要的評估價值[2].MicroRNA(miRNA)是在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類非編碼性的內(nèi)源性RNA，約含20～25個核苷酸，具有各種調(diào)控功能.miRNA擁有多種生物學(xué)活性，對人體的生長發(fā)育，尤其對惡性腫瘤的產(chǎn)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程有重大影響，是肺癌領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點[3-5].本研究旨在探討NSCLC患者外周血中miRNA-10b的表達情況與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、肝腦等遠處轉(zhuǎn)移和病理TNM分期的相關(guān)性.

1 材料和方法

1.1 材料標(biāo)本

選擇2015年11月—2019年11月在北華大學(xué)附屬醫(yī)院確診的NSCLC患者156例，105例入實驗組，51例排除.另選50例同期體檢健康人員為正常對照組，所有受試者均簽署臨床實驗告知書.采集NSCLC患者外周血清3 mL，制備用于miRNA-10b檢測的RNA提取液，吸光度在1.8～2.1之間.

1.2 主要藥品及設(shè)備

CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量檢測儀(Eppendorf公司，德國)；Ficoll單個核細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)；mirVana miRNA試劑盒(Ambion公司，美國)；乙二胺四乙酸(EDTA)SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒(Solarbio公司，美國).

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 方 法

2.1 單個核細胞中RNA的提取

采集NSCLC患者外周血清3 mL，應(yīng)用絡(luò)合劑EDTA將外周血清抗凝，應(yīng)用Ficoll液分離外周血單個核細胞，并放置在-80 ℃冰箱中保存待用；應(yīng)用 miRNA試劑盒提取單個核細胞中的總RNA，進一步檢測miRNA-10b濃度.

2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR測定miRNA-10b

取2 μL RNA液進行反轉(zhuǎn)錄，再加入2 μL RT Primer+無核酸酶水，10 min 70 ℃反應(yīng)后冰浴2 min.向上述混合物中依次加入RT buffer、dNTP、RNase inhibitor、RT酶、ddH2O，繼續(xù)進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件設(shè)定為60 min 42 ℃、10 min 70 ℃，之后維持在4 ℃左右.以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μL作為標(biāo)準(zhǔn)模板，應(yīng)用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒檢測RT-qPCR，采用熒光定量PCR儀進行3次獨立檢驗.

3 結(jié) 果

3.1 外周血單核細胞中miRNA-10b相對表達量

實驗組外周血單核細胞中miRNA-10b相對表達量為1.85±0.14，而正常對照組外周血單核細胞中miRNA-10b相對表達量為1.03±0.18，實驗組明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見圖1.

圖1外周血單核細胞中miRNA-10b相對表達量Fig.1Relative expression of miRNA-10b in peripheral blood mononuclear cells

3.2 外周血單核細胞中miRNA-10b表達對NSCLC的診斷價值

外周血單核細胞中miRNA-10b表達的曲線下面積(AUC)為0.870(95%CI：0.908～0.813，P<0.01)，當(dāng)ROC曲線臨界值(cut-off)為1.15時，診斷靈敏度(86.5%)和特異度(81.7%)最高.見圖2.

圖2外周血單核細胞中miRNA-10b的靈敏度和特異度 Fig.2Sensitivity and specificity of miRNA-10b in peripheral blood mononuclear cells

3.3 臨床病理因素對miRNA-10b的影響

以ROC曲線臨界值(cut-off)1.15為分界值，105例非小細胞肺癌患者中miRNA-10b表達≥1.15為高表達組，<1.15為低表達組，其中高表達的患者71例，低表達的患者34例.miRNA-10b表達和吸煙、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理TNM分期相關(guān)(P<0.05)，吸煙史>10 a、肺腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者、TNM分期較晚的Ⅱ、Ⅳ期患者高表達多，而其他臨床病理因素與miRNA-10b無相關(guān)性(P>0.05).見表1.

表1 NSCLC患者臨床病理因素對miRNA-10b的影響Tab.1 Effects of various factors on miRNA-10b in patients with non-small cell lung cancer

4 討 論

目前，我國肺癌發(fā)病率和死亡率均居首位，已成為危害健康的重要疾病[6-8]，也是我國公民的首要死亡原因.由于大部分肺癌患者確診時已處于腫瘤晚期，治療手段有限，復(fù)發(fā)和耐藥性導(dǎo)致其臨床治愈率不高.近年來，MicroRNA(miRNA)因其可以通過調(diào)控細胞周期、介導(dǎo)細胞凋亡、血管生成和細胞轉(zhuǎn)移來參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，成為目前研究的熱點[9-10].

MicroRNA(miRNA)是在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類非編碼性內(nèi)源性的RNA，miRNA大小約20～25個核苷酸，miRNA具有各種調(diào)控功能，它們作為基因調(diào)控因子發(fā)揮抑制靶基因表達的作用.miRNA能夠阻抑蛋白翻譯，通過miRNA的3’末端非翻譯區(qū)調(diào)控靶基因[11-13].有研究[10]發(fā)現(xiàn)：非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清中miR-146b、miR -155、miR-27a和miR-106a的表達顯著降低，而miR29c的表達顯著升高；肺癌患者外周血單個核細胞中的miR-155、miR-10b、miR-141的表達水平比肺良性腫瘤患者高，所以外周血單個核細胞中的 miR-10b可能作為肺癌早期診斷及治療效果評估的分子生物學(xué)工具.

由于肺癌的惡性程度及死亡率極高，所以肺癌患者的預(yù)后評估是臨床的一項重要內(nèi)容，miRNA 的出現(xiàn)極可能為我們提供一種全新的方法.有研究[11]表明：miRNA表達水平的異常有助于判斷肺癌患者預(yù)后和生存期，通過多因素分析研究也證實 miRNA-10b的高表達是一種獨立因素，可預(yù)測肺癌的治療效果.有研究[12]探討了 miRNA-10b在肺癌細胞系PANC-1中的表達情況，并進一步探討了miRNA-10b對肺癌細胞系 PANC-1的生物學(xué)功能的影響.結(jié)果表明：miRNA-10b的表達量在能夠手術(shù)切除患者術(shù)后外周血中明顯低于手術(shù)無法切除患者的表達量，同時miRNA-10b 的表達對肺癌患者生存期還具有預(yù)測作用，miRNA-10b高表達的肺惡性腫瘤患者中位生存時間為6個月，而低表達水平的患者為2 a.KHANDELWAL A等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，有46例非小細胞肺癌患者的肺癌組織及癌旁正常組織中的miRNA比正常組織中miRNA表達上升了14%，腫瘤周圍正常組織中 miRNA含量與正常肺組織中含量基本接近；其中，腫瘤細胞中miRNA21含量比肺癌旁周圍正常組織高2.5倍，而肺癌消失后肺組織中miRNA21含量則與正常組織接近.

本研究中，實驗組患者外周血單核細胞miRNA-10b表達為1.85±0.14，而正常對照組外周血單核細胞miRNA-10b表達為1.03±0.18，實驗組明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).miRNA-10b表達和吸煙、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理TNM分期相關(guān)(P<0.05)，吸煙史>10 a的患者高表達明顯多，病理TNM分期為Ⅲ期、Ⅳ期高表達數(shù)多，而其他臨床病理因素如性別與miRNA-10b無相關(guān)性(P>0.05).本研究結(jié)果顯示：miRNA-10b作為一種新型腫瘤標(biāo)志物，能夠區(qū)別于其他腫瘤標(biāo)志物，miRNA-10b外周血具有采集方便、物質(zhì)穩(wěn)定、陽性率高的特點，其表達高低與肺癌嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，受年齡等干擾因素小，能比較客觀地反映肺癌的生物學(xué)特征.

綜上，miRNA為一種分子生物學(xué)標(biāo)志物，可用來診斷及預(yù)測肺癌的預(yù)后，因此，深入探討參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的miRNA具有重要意義.