郝 爽 , 劉麗君 陳軍輝, 何秀平, 連子如

(1. 山東大學 海洋學院, 山東 威海 264209; 2. 自然資源部第一海洋研究所, 自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學與技術(shù)重點實驗室, 山東 青島 266061)

近年來, 人類活動導致大氣中CO2含量迅速上升,從工業(yè)革命開始時的280 ppm 增至當今的411 ppm[1]。大氣中CO2含量上升不僅會造成氣候變暖, 還會導致海洋中溶解CO2含量增加和海水pH 值降低。目前,表層海水的平均pH 值約為8.10[2], 預(yù)計到2100 年將下降至7.8 或7.7, 到2300 年將下降至7.4～7.6, 將對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重影響[3]。富營養(yǎng)化是一種由于水體中氮和磷含量、相對比例或化學形態(tài)發(fā)生變化而導致水體中生產(chǎn)力, 尤其是有機質(zhì)不斷增加的過程[4], 是水質(zhì)退化的主要原因之一, 對世界上許多水生態(tài)系統(tǒng)造成重大破壞[5], 還會對人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展構(gòu)成威脅[6]。藻類作為最重要的初級生產(chǎn)者之一, 是海洋食物網(wǎng)的基礎(chǔ), 海水酸化和富營養(yǎng)化引起的海水環(huán)境變化勢必也會影響到海洋藻類的生理機能。

隨著全球氣候問題的加劇, 海洋產(chǎn)毒藻在全球海域的分布范圍越來越大[7-8], 尤其是麻痹性貝毒(PST)毒素產(chǎn)毒藻[9-10]。海洋環(huán)境中能夠產(chǎn)生PST 的微藻主要有微小亞歷山大藻、鏈狀亞歷山大藻[11-12]、鏈狀裸甲藻[13]和巴哈馬梨甲藻[14]等, 這些產(chǎn)毒甲藻在全球近岸海域廣泛分布, 嚴重威脅近海養(yǎng)殖環(huán)境安全。其中, 文獻報道我國多起PST 中毒事件是由亞歷山大藻屬和裸甲藻屬的部分有毒藻種造成的[15-16]。

氮、磷作為產(chǎn)毒藻進行生理活動必需的營養(yǎng)元素[3], 在富營養(yǎng)化的產(chǎn)生和赤潮的暴發(fā)中起著重要的驅(qū)動作用。有研究表明, 亞歷山大藻細胞的毒性可能同時受到N 和P 濃度的影響, 并且隨著N/P 的變化而變化[17]。從PST 的化學結(jié)構(gòu)式可以看出, N 元素含量約占PST 分子的30%, N 元素與亞歷山大藻產(chǎn)毒有著十分密切的聯(lián)系。關(guān)于酸化研究, 在室內(nèi)培養(yǎng)實驗中, 最初用化學方法調(diào)控培養(yǎng)液的pH 值, 使用強酸模擬酸化環(huán)境, 探究pH 變化對水生生物的影響。如用鹽酸調(diào)節(jié)pH 對云紋石斑魚胚胎發(fā)育和仔魚活力以及文蛤的呼吸與排泄進行研究[18-19], 王越等[20]通過用鹽酸探究了pH 對米氏凱倫藻生理代謝的影響。然而, 有毒甲藻在強酸調(diào)節(jié)的酸化海水中產(chǎn)毒響應(yīng)的相關(guān)研究目前鮮有報道。目前在產(chǎn)毒藻對環(huán)境因子的響應(yīng)方面的研究多是針對溫度、鹽度、海水酸化或營養(yǎng)條件等單因素, 而兩個及兩個以上因素的聯(lián)合作用對有毒甲藻的影響研究較少, 關(guān)于所釋放的胞外毒素的濃度、組成等也沒有明確報道。那么, 在多種環(huán)境因子的聯(lián)合作用下有毒甲藻產(chǎn)毒的規(guī)律是怎樣, 胞內(nèi)外毒素組成、含量是否有明顯差異, 這些問題值得深入研究探討。

基于以上論述, 本工作選取我國近海典型產(chǎn)毒甲藻微小亞歷山大藻(A. minutum)作為研究對象, 通過強酸酸化方法, 聯(lián)合一定條件下的富營養(yǎng)化模式,構(gòu)建基于氮濃度變化的不同氮磷比條件下的酸化海水環(huán)境, 分析測定了胞內(nèi)外毒素的含量組分以及藻密度、葉綠素含量等相關(guān)數(shù)據(jù), 初步探討了在較高氮磷比條件下的酸化海水對A. minutum產(chǎn)毒的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

G1969A 型飛行時間質(zhì)譜儀和1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司); ZIC-HILIC 色譜柱(德國MERCK 公司); GTX1、GTX2、GTX3、GTX4 標準品(NRC-IMB), 用0.1 mol/L 乙酸溶液稀釋后濃度分別為497 μg/L、903 μg/L、343 μg/L、162 μg/L; 產(chǎn)毒微小亞歷山大藻分離自臺灣海峽, 株號AM-1。

1.2 藻的培養(yǎng)與收集

取天然海水, 經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后高溫高壓滅菌, 冷卻至室溫。以NaNO3作為氮源, NaH2PO4作為磷源, 微量元素和維生素的初始濃度按照f/2 培養(yǎng)基配方添加, NaH2PO4初始濃度為9.7±0.3 μmol/L, 通過改變NaNO3濃度改變培養(yǎng)液的氮磷比。向500 mL的錐形瓶中添加300 mL 培養(yǎng)液,A. minutum初始密度為1×103個/mL, 設(shè)置明暗比(L︰D)為12 h︰12 h、培養(yǎng)溫度20℃、光照強度3 000 lx, 培養(yǎng)過程中定時搖動錐形瓶。每天用1 mol/L 的鹽酸和1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)控培養(yǎng)液的pH 值。實驗設(shè)置兩個pH值(8.0, 7.5)和兩個氮磷比(80︰1, 40︰1)共4 個組合,如表1 所示。

表1 實驗組的設(shè)置Tab. 1 Setting of the experimental group

培養(yǎng)周期為34 天, 每隔3 天收集3 瓶藻液。從每個錐形瓶的300 mL 藻液中各取1 mL 混勻的培養(yǎng)液, 置于2 mL 離心管中, 加入1 滴Lugol’s 碘液, 用于藻細胞的計數(shù); 各取2 mL 混勻藻液抽濾至直徑25 mm 的GF/F 膜上, 用于葉綠素a的測定; 將剩余藻液中藻細胞收集至GF/A 膜上, 實現(xiàn)藻細胞與培養(yǎng)液的分離; 用孔徑為0.22 μm 的混合纖維濾膜對培養(yǎng)液進一步過濾。

1.3 測定方法

藻密度、葉綠素a及營養(yǎng)鹽(NO3-N、NO2-N、NH4-N 和PO4-P)的測定以及A. minutum胞內(nèi)胞外PST的提取、富集和儀器檢測方法參照文獻[21-22]。溶解無機氮(DIN)為NO3-N、NO2-N、NH4-N 濃度之和。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS 26.0 的One-way ANOVA 和LSD (Least Significant Difference, 最小顯著性差異法)多重比較分析,P<0.05 為差異顯著,P<0.01 為差異極顯著; 使用 Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 對生長的影響

圖1 不同氮磷比條件下酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻密度的影響Fig. 1 Effect of acidification on the density of A. minutum under different N/P ratios

不同氮磷比條件下培養(yǎng)液酸化對A. minutum生長狀況的影響如圖1 所示。各實驗組A. minutum生長可分為四個階段: 遲緩期、指數(shù)生長期、平臺期和衰亡期。N/P=80︰1 時,A. minutum進入指數(shù)生長期和平臺期的時間比N/P=40︰1 條件下提前5 天左右, 適當降低培養(yǎng)液的pH 值可以提高A. minutum的最大細胞數(shù)。N/P=40︰1 時, pH=8.0 條件下A. minutum的最大細胞數(shù)反而顯著高于pH=7.5 條件。

2.2 對葉綠素a 的影響

如圖2a 所示，A. minutum葉綠素a含量在培養(yǎng)周期中先增加后減少, 與圖1 中微小亞歷山大藻密度變化趨勢基本一致。每個細胞內(nèi)葉綠素a含量(pg/細胞)的變化情況與單位體積含量(μg/L)在不同實驗條件下的相對關(guān)系基本一致, 除實驗組Ⅳ中每個細胞內(nèi)葉綠素a含量隨生長周期不斷減少之外, 其余三組的細胞葉綠素a含量在整個生長周期中變化不大(見圖2b)。從表2 可以看出微小亞歷山大藻密度與葉綠素a含量成正相關(guān)關(guān)系, 氮磷比的改變和酸化環(huán)境沒有改變這種關(guān)系。在A. minutum的培養(yǎng)周期中, 葉綠素a含量隨培養(yǎng)液pH 值的變化而發(fā)生改變:生長初期, 葉綠素a含量隨培養(yǎng)液pH 值的降低而降低; 進入指數(shù)生長期后, 培養(yǎng)液pH 降低時A. minutum葉綠素a含量增加極為顯著 (P<0.01)。

圖2 不同氮磷比條件下的酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻葉綠素a 含量的影響Fig. 2 Effect of acidification on the chlorophyll a content of A. minutum under different N/P ratios

表2 葉綠素a 與藻密度的相關(guān)性Tab. 2 Correlation between chlorophyll a and algal density

2.3 對營養(yǎng)鹽(DIN 和PO4-P)的測定

培養(yǎng)液中DIN 和PO4-P 濃度變化趨勢不同(圖3)。不同實驗條件下的微小亞歷山大藻在前五天快速吸收PO4-P, 四組實驗分別吸收培養(yǎng)液中PO4-P 的64.03%(Ⅰ)、52.19%(Ⅱ) 、73.65%(Ⅲ)和62.58%(Ⅳ)。之后培養(yǎng)液中PO4-P 的含量沒有明顯變化。N/P=80︰1實驗組培養(yǎng)周期內(nèi)DIN 的濃度大致呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢, 而N/P=40︰1 的兩組培養(yǎng)液中DIN 的濃度則隨培養(yǎng)時間而減少。其中NO3-N 作為培養(yǎng)基中添加的唯一氮源, 與DIN 的變化趨勢基本一致; NH4-N濃度則隨著A. minutum的生長呈現(xiàn)波動上升的趨勢;NO2-N 占DIN 的比例不足1%, 且對A. minutum的生長影響不大, 在此不予討論。

2.4 對毒素的影響

為了更直觀地比較不同氮磷比條件下的酸化培養(yǎng)液對A. minutum生長和產(chǎn)毒的影響, 根據(jù)4 組實驗的藻密度曲線選取五個點進行分析: 遲緩期(樣品1),指數(shù)前期(樣品2), 指數(shù)后期(樣品3), 最大生物量所在的樣品(樣品4), 衰亡期(樣品5)。

2.4.1 對A. minutum 胞內(nèi)毒素的影響

不同氮磷比條件下酸化培養(yǎng)液對A. minutum單位細胞毒素總量的影響見圖4。N/P=40︰1 時, pH 的改變對指數(shù)期至衰亡期A. minutum單位細胞總毒素含量的影響并不明顯(P>0.05); 而當?shù)妆容^高(N/P=80︰1)時, 與A. minutum藻細胞生長趨勢不同,pH 的降低反而顯著降低了A. minutum單位細胞總毒素含量(P<0.01)。相同培養(yǎng)液pH 條件下, N/P=80︰1條件下的A. minutum細胞在衰亡期積累的毒素迅速增加, 含量比N/P=40︰1 條件下高出57.8%(pH=8.0)和42.5%(pH=7.5)。

在不同生長時期A. minutum胞內(nèi)4 種PST 總量及毒素組成如圖5 所示, 可以看出胞內(nèi)PST 總量隨培養(yǎng)時間基本呈現(xiàn)增加的趨勢, 尤其在N/P=80︰1 時,毒素含量增加顯著。胞內(nèi)GTX1 和GTX4 隨培養(yǎng)時間基本呈現(xiàn)增高的趨勢, GTX2 和GTX3 含量變化不大甚至減少。N/P=80︰1 時, 4 種PST 在遲緩期的含量隨pH 降低而增加, 而在指數(shù)期至衰亡期, 各毒素反而隨pH 的降低而降低。N/P=40: 1 條件下, 在pH 降低時各毒素含量除遲緩期外增加了5.04% ～ 62.38%。

圖3 不同氮磷比條件下酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽含量的影響Fig. 3 Effects of acidification on nutrient content in A. minutum culture medium under different N/P ratios

圖4 不同氮磷比條件下酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻單位細胞毒素總量的影響Fig. 4 Effect of acidification on the total amount of PST of an A. minutum cell under different N/P ratios

2.4.2 對A. minutum 胞外毒素的影響

不同氮磷比條件下酸化培養(yǎng)液對A. minutum胞外培養(yǎng)液中PST 總量的影響如圖6 所示。相同pH條件下, N/P=80︰1 時衰亡期之前胞外培養(yǎng)液的PST含量明顯高于 N/P=40︰1 條件, 而到衰亡期時,N/P=40︰1 條件下培養(yǎng)液中PST 迅速增加, 40/7.5 實驗組中毒素含量超過80/7.5 實驗組。不同氮磷比條件下pH 對衰亡期之前的A. minutum胞外培養(yǎng)液中PST 總量無明顯影響, N/P=80︰1 條件下的A. minu-tum到達衰亡期時, pH=8.0 條件下的胞外PST 含量迅速增加, 超過了較低pH 條件下毒素含量71.05%。

在不同生長時期A. minutum胞外培養(yǎng)液中PST含量以及毒素組成如圖7 所示(圖中數(shù)據(jù)為三組平行實驗結(jié)果的平均值), 胞外培養(yǎng)液中PST 總量隨培養(yǎng)時間均呈現(xiàn)增加的趨勢。氮磷比較高(N/P=80︰1)時,pH 降低并未顯著促進PST 總量的增加(P>0.05), 但在衰亡期之前胞外培養(yǎng)液中GTX2 和GTX3 占比隨pH 降低而提高, GTX1 和GTX4 與之相反, 在pH=7.5時其濃度較低; N/P=40︰1 時, pH 變化對胞外培養(yǎng)液中PST 的含量及組成無明顯影響(P>0.05)。

圖5 4 組實驗微小亞歷山大藻胞內(nèi)PST 總量的變化Fig. 5 Changes in the total amount of intracellular PST in A. minutum in four experimental groups

圖6 不同氮磷比條件下酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻胞外培養(yǎng)液中總毒素的影響Fig. 6 Effects of acidification on the total amount of extracellular PST in A. minutum under different N/P ratios

2.4.3 對A. minutum胞外毒素與胞內(nèi)毒素比值的影響

本實驗將A. minutum胞外培養(yǎng)液中4 種PST 與胞內(nèi)進行比較, 得到單位體積中胞外培養(yǎng)液和胞內(nèi)4 種PST 物質(zhì)的量(nmol)以及毒素總量(nmol)的平均值的比值(圖8、圖9)。PST 總量的比值以及GTX1、GTX4、GTX2、GTX3 各自比值的變化規(guī)律相似: 衰亡期之前,N/P=80︰1 條件下二者比值高于N/P=40︰1 條件下的比值, 在遲緩期尤為明顯(P<0.01), 且遲緩期時隨著pH 的降低二者比值減小59.2%。指數(shù)生長期胞外與胞內(nèi)毒素的比值隨著pH 的降低而增加。衰亡期時,N/P=40︰1 時的胞外/胞內(nèi)毒素比值高出N/P=80︰1條件下比值的52.4%。所以, 較高氮磷比條件下, 特別是在遲緩期和指數(shù)期, 酸化環(huán)境對A. minutum胞外培養(yǎng)液中4 種PST 的含量與胞內(nèi)的比值會產(chǎn)生影響(P<0.05)。

圖7 4 組實驗微小亞歷山大藻胞外培養(yǎng)液中PST 總量的變化Fig. 7 Changes in the total amount of extracellular PST of A. minutum in four experimental groups

圖8 不同氮磷比條件下酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻胞外毒素與胞內(nèi)毒素總量比值的影響Fig.8 Effects of acidification on the ratio of total extracellular PST to total intracellular PST in A. minutum under different N/P ratios

3 討論

現(xiàn)有的大多數(shù)關(guān)于酸化環(huán)境對亞歷山大藻生長及產(chǎn)毒影響的研究是通過CO2加富進行酸化實驗。有研究顯示, 由于碳濃縮機制的存在, CO2濃度的在一定范圍內(nèi)升高并不會對亞歷山大藻的生長產(chǎn)生明顯影響, 但會使與次級代謝產(chǎn)物生物合成、運輸和分解代謝以及氨基酸運輸相關(guān)的下調(diào)基因數(shù)量增加,從而降低塔瑪亞歷山大藻株毒素含量[23]。與通過CO2加富模擬酸化環(huán)境不同, 本實驗采用鹽酸來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH, 探究高氮磷比條件下酸化環(huán)境對A.minutum生長和產(chǎn)毒的影響。

圖9 不同氮磷比條件下酸化環(huán)境對微小亞歷山大藻胞外與胞內(nèi)不同毒素的比值的影響Fig. 9 Effects of acidification on the ratios of different extracellular to intracellular toxins in A. minutum under different N/P ratios

3.1 對A. minutum 生長的影響

雖然氮是蛋白質(zhì)和核酸等生命物質(zhì)的重要組成元素, 但是在本實驗中, 氮磷比較高(N/P=80︰1)時并沒有對產(chǎn)毒微小亞歷山大藻的生長產(chǎn)生促進作用,可能是過量氮在藻體內(nèi)蓄積轉(zhuǎn)變成有害物質(zhì), 從而對藻的生長造成不利影響。但pH 值降低會促進有毒甲藻的生長, 增長速度快且最大生物量高, 進而引發(fā)危害程度更高的有毒赤潮。

A. minutum產(chǎn)生的PST 是一種富含氮的生物堿[17],而磷元素是A. minutum遺傳物質(zhì)核酸的重要組成成分之一[24],A. minutum細胞內(nèi)PST 含量與培養(yǎng)液營養(yǎng)狀況密切相關(guān)。本研究顯示A. minutum在培養(yǎng)的前五天快速吸收培養(yǎng)液中的PO4-P, 對P 采取儲存策略;在培養(yǎng)周期的中后段,A. minutum幾乎不再從培養(yǎng)液中吸收P; 而A. minutum在整個生長過程中持續(xù)消耗氮, 對氮營養(yǎng)鹽沒有明顯的儲存策略。當細胞死亡破裂時, 胞內(nèi)未吸收利用的NO3-N 可能會重新釋放到培養(yǎng)液中, 導致培養(yǎng)后期培養(yǎng)液中DIN 升高。N 在生物體內(nèi)會發(fā)生轉(zhuǎn)化, 部分NO3-N 可能在A. minutum中轉(zhuǎn)化成NH4-N, 并隨著的藻細胞生長周期被利用或釋放。酸化環(huán)境下, 氮磷比的升高可能會降低A.minutum的磷儲存能力而對藻的氮吸收能力沒有明顯的影響。

3.2 對A. minutum 產(chǎn)毒的影響

氮磷比增加有利于A. minutum胞內(nèi)GTX1 和GTX4 的占比的增加, 使A. minutum產(chǎn)生的PST 向毒性更高的化合物轉(zhuǎn)變, 其中衰亡期毒素含量更高。Mohamed 的觀點可以解釋這一現(xiàn)象: 亞歷山大藻進入衰亡期后, 細胞分裂間期延長, 細胞分裂的速度減緩甚至停滯, 而PST 合成酶的編碼基因仍持續(xù)表達, PST 可持續(xù)合成[25], 使得衰亡期的A. minutum胞內(nèi)PST 高于其他生長時期。衰亡期的A. minutum胞外培養(yǎng)液中PST 總量也比其他生長時期要高, 可能原因有二: (1) 衰亡期微小亞歷山大藻胞內(nèi)PST 含量高于其他生長時期, 所以釋放到胞外培養(yǎng)液中的PST 也會更多; (2) 藻細胞進入到衰亡期, 死亡、裂解速度加快,A. minutum胞內(nèi)的毒素直接進入到培養(yǎng)基質(zhì), 導致胞外PST 含量升高。本實驗的結(jié)果與Lim 的研究結(jié)果基本一致, 認為亞歷山大藻細胞的毒性隨著N/P 的變化而變化, 在不同的N/P 處理下A. minutum的毒素組成相對穩(wěn)定, 在較高的N/P 條件下培養(yǎng)的藻細胞的毒素含量也比較多[17]。此外Han 還發(fā)現(xiàn), 在高氮條件下的PST 種類更加豐富[26], 這點在本實驗中并未體現(xiàn),可能存在實驗藻株之間的差異。

較高氮磷比條件下的酸化環(huán)境使胞外培養(yǎng)液中PST 含量比胞內(nèi)增加的程度高。在指數(shù)前期之前,A. minutum胞外培養(yǎng)液中PST 的總量較胞內(nèi)可高出20 倍以上, 這可能是處于酸化環(huán)境中的微小亞歷山大藻為了提高在惡劣環(huán)境下的生存能力而向環(huán)境中釋放更多的毒素來提高自身競爭力; 也可能是酸化環(huán)境會提高藻細胞內(nèi)相關(guān)酶的含量或活性[27], 進而促進藻細胞的生理代謝以及PST 的合成與釋放。綜上所述, 在富營養(yǎng)化條件下, 日益嚴重的酸化情況可能會導致海水中PST 含量與藻胞內(nèi)的比值顯著增加, 嚴重威脅到海水環(huán)境。

4 結(jié)論

微小亞歷山大藻對氮磷比和pH 的變化較為敏感, 在本實驗中, 酸化環(huán)境對A. minutum的生長、毒素含量和毒性有一定促進作用, 可以推測日益酸化的海水環(huán)境或許在一定程度上會加劇A. minutum引起的有毒赤潮。但也有其他研究表明酸化對亞歷山大藻生長和產(chǎn)毒有一定的抑制作用, 可見酸化對亞歷山大藻的影響十分復雜。酸化環(huán)境如何影響亞歷山大藻的生長和產(chǎn)毒？不同酸化模式對亞歷山大藻的作用機制是否一致？尚未有明確統(tǒng)一的定論。酸化環(huán)境下氮磷比增加并沒有促進A. minutum的生長,且降低了其葉綠素a含量和對P 的儲存能力, 但幾乎沒有影響到對硝氮的吸收能力。氮磷比的增加還促進了A. minutum胞內(nèi)和胞外毒素含量和毒性的增加,這更加增大了A. minutum赤潮產(chǎn)生的環(huán)境危害。本研究通過探究無CO2參與的酸化環(huán)境和氮加富的共同作用對微小亞歷山大藻生長產(chǎn)毒的影響, 以期為酸化和富營養(yǎng)化條件下的微藻產(chǎn)毒提供更多研究基礎(chǔ)。