黃 武,王曉丹,邱樹毅,曹文濤,周鴻翔,羅小葉,班世棟*
(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)
醬香型白酒生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量酒糟,其主要是由高粱、小麥和稻殼等廢棄固形物組成。酒糟中含有豐富的營養(yǎng)成分[1],常用于制備動物飼料[2-3]和肥料[4-5]。微生物發(fā)酵處理是用于改善酒糟品質(zhì)生產(chǎn)飼料和有機(jī)肥的有效手段,在發(fā)酵過程中,微生物可以產(chǎn)生一些復(fù)雜的酶系,從而改善酒糟的品質(zhì),其主要有單菌種發(fā)酵[6]和復(fù)合菌種發(fā)酵[7]技術(shù)。目前報(bào)道的關(guān)于醬香型酒糟的研究主要是在動物飼料、食用菌栽培和功能性微生物篩選分離等方面的應(yīng)用。鄭應(yīng)家等[8]在荷斯坦奶牛日糧中添加發(fā)酵后的醬香型酒糟,結(jié)果表明此舉可以提高飼料的利用率,提升奶牛的產(chǎn)奶量,延長泌乳周期。陸承云等[9]研究了醬香型酒糟栽培姬松茸的效果,結(jié)果表明醬香型酒糟可以用于姬松茸的栽培,但應(yīng)控制酒糟的添加量。白成松等[10-11]從醬香型酒糟中篩選到了對酒糟纖維素有一定降解效果的高溫放線菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),在酒糟綜合利用方面具有一定的潛力。關(guān)于醬香型酒糟來源的功能性微生物改善醬香型酒糟品質(zhì)和揮發(fā)性成分影響的報(bào)道較少。
庫德里阿茲威(氏)畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)(FBKL2.0008)和白耙齒菌(Irpex lacteus)(FBKL3.0021)是從醬香型酒糟和大曲中篩選分離出的兩株產(chǎn)香菌,其對酒糟微環(huán)境的耐受能力有明顯優(yōu)勢,并且能夠產(chǎn)生多種纖維素酶,在酒糟纖維素降解方面具有一定的潛力。本試驗(yàn)利用兩株優(yōu)良菌種對廢棄酒糟進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵處理,通過測定酒糟的微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分,探究兩株優(yōu)良菌種對酒糟品質(zhì)的改善效果和揮發(fā)性成分的影響,以期為后期醬香型酒糟發(fā)酵工藝優(yōu)化處理提供數(shù)據(jù)支撐。
1.1.1 試劑
酒糟取自茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒酒廠粹沙酒糟;庫德里阿茲威(氏)畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)(FBKL2.0008)和白耙齒菌(Irpex lacteus)(FBKL3.0021)為實(shí)驗(yàn)室從醬香型酒糟和醬香大曲中分離的產(chǎn)香功能菌,均由貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;植物金屬硫蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒:上海源葉生物科技有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.2 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL、pH自然。以不加瓊脂的培養(yǎng)基制成PDA液體培養(yǎng)基。
麩皮培養(yǎng)基:15 g麩皮裝于50 mL搖瓶中,加入15 mL蒸餾水,攪拌均勻后于121 ℃下滅菌20 min。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
Thermo CR3i多功能冷凍離心機(jī):美國賽默飛世爾科技公司;HP 7890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀:美國安捷倫公司;2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取頭:美國Supelco公司。
1.3.1 酵母種子液
將畢赤酵母(FBKL2.0008)接種到PDA斜面上30 ℃活化兩次,再接種到100 mL PDA液體培養(yǎng)基中,在30 ℃條件下培養(yǎng)1 d制成酵母種子液,用于酒糟發(fā)酵。
1.3.2 白耙齒菌擴(kuò)大培養(yǎng)
將白耙齒菌(FBKL3.0021)接種到PDA斜面上30 ℃活化兩次,再接種到PDA斜面中,30 ℃生長7 d,加入5 mL生理鹽水,用接種環(huán)刮下培養(yǎng)基上菌絲,混勻,取1 mL接種到麩皮培養(yǎng)基中,攪拌均勻,在30 ℃條件下培養(yǎng)3 d,制成擴(kuò)大培養(yǎng)基。
1.3.3 醬香型酒糟微生物指標(biāo)測定
對粹沙酒糟的細(xì)菌、霉菌和酵母數(shù)量分別計(jì)數(shù),細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù),酵母和霉菌用PDA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。
1.3.4 醬香型酒糟部分理化指標(biāo)的測定
酒糟中水分、淀粉和還原糖含量測定參考T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》;粗纖維的含量參考GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維測定方法》中的過濾法測定[13];粗蛋白的測定參考GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》中的凱氏定氮法[14];粗脂肪含量的測定參考GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》[15];粗灰分含量的測定參考GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》[16];多糖含量測定參考董鈺明等[17]的方法。無氮浸出物計(jì)算公式如下:
無氮浸出物(%)=100%-(水分%+粗蛋白%+粗脂肪%+粗纖維%+粗灰分%)
1.3.5 醬香型酒糟金屬硫蛋白含量的測定
金屬硫蛋白的提?。喝⊙心ゾ圃? g,加入10 mL 0.1 mol pH8.6的Tris-HCl緩沖液,用電動玻璃勻漿器在冰浴條件下充分?jǐn)嚢?,勻漿液放于4 ℃,浸提5~8 h后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min;收集上清液,并于100 ℃水浴加熱5 min,然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min,棄沉淀,上清液中加入3倍體積無水乙醇于-20 ℃過夜;取沉淀,加入2 mL 0.01 mol/L Tris-HCI緩沖液室溫溶解4 h,然后于4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清,此即為金屬硫蛋白粗提取液。根據(jù)植物金屬硫蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作說明測定樣品中金屬硫蛋白含量。以上理化指標(biāo)均平行測定3次,結(jié)果取平均值。
1.3.6 醬香型酒糟揮發(fā)性成分測定
取酒糟樣品約5 g,置于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex固相微萃取頭的手動進(jìn)樣器,在50 ℃左右頂空萃取30 min取出,快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250℃)中,熱解析3 min進(jìn)樣。
色譜柱為ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,柱溫40 ℃(保留2 min),以4 ℃/min升溫至280 ℃,保持2 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純氦氣(He)(99.999%);柱前壓7.62 psi,載氣流量1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣;溶劑延遲時(shí)間:1.5 min;離子源為電子電離源(electron ionization,EI);離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1 428 V;接口溫度280 ℃;質(zhì)量范圍20~450 amu。
對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,確定了揮發(fā)性化學(xué)成分,用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對含量。
1.3.7 菌株發(fā)酵
酵母發(fā)酵:在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇錐形瓶薄膜封口方式進(jìn)行發(fā)酵。稱取100 g酒糟,調(diào)節(jié)pH5~6,接種酵母10%(V/V),發(fā)酵時(shí)間為7 d,發(fā)酵溫度為28 ℃。
白耙齒菌發(fā)酵:在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇錐形瓶薄膜封口方式進(jìn)行發(fā)酵。稱取20 g酒糟(在60 ℃下烘干10 h),加20 mL蒸餾水,調(diào)節(jié)pH5~6,按體積分?jǐn)?shù)10%接種白耙齒菌擴(kuò)大培養(yǎng)基,發(fā)酵時(shí)間為7 d,發(fā)酵溫度為30 ℃。
發(fā)酵結(jié)束后,測定酒糟的微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分。
酒糟發(fā)酵前后微生物計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。由表1可知,原酒糟中主要的微生物為細(xì)菌屬,未檢測出酵母和霉菌,經(jīng)酵母和白耙齒菌發(fā)酵后,各項(xiàng)微生物指標(biāo)的數(shù)量均顯著增加。其中,酵母組中共檢測出細(xì)菌1.68×107CFU/g和酵母6.00×107CFU/g;白耙齒菌組共檢測出細(xì)菌、酵母和霉菌三種微生物,其數(shù)量分別為2.10×106CFU/g、7.90×105CFU/g和3.00×103CFU/g。
表1 酒糟發(fā)酵前后微生物計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Microbe count results of distiller's grains before and after fermentation
由微生物指標(biāo)計(jì)數(shù)結(jié)果可知原酒糟中微生物種類較為單一,其原因可能是因?yàn)獒u香型酒糟中pH值較低[18],微生物如霉菌等無法在這種極端pH值環(huán)境中生長;其次,本試驗(yàn)所用的畢赤酵母和白耙齒菌均能利用醬香型酒糟進(jìn)行生長和代謝,且白耙齒菌對酒糟的利用程度優(yōu)于酵母。
由圖1可知,原酒糟中水分含量達(dá)65.19 g/100 g,發(fā)酵后,其水分含量的變化較小,其中,酵母組的水分含量為62.93 g/100 g,白耙齒菌組的水分含量為59.43 g/100 g。
圖1 醬香型酒糟部分理化指標(biāo)測定結(jié)果Fig.1 Determination results of part physicochemical indexes of sauce-flavor distiller's grains
原酒糟中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、無氮浸出物和淀粉的含量分別為8.42 g/100 g、2.90 g/100 g、4.18 g/100 g、3.24 g/100 g、16.07 g/100 g和13.67 g/100 g。經(jīng)酵母菌發(fā)酵后,酒糟中粗脂肪、粗纖維、粗灰分和淀粉含量均有所下降,其中淀粉含量為9.19 g/100 g,下降了32.77%,粗脂肪、粗纖維和粗灰分下降幅度較小,分別為2.68 g/100 g、3.95 g/100 g和2.78 g/100 g;而酒糟中粗蛋白和無氮浸出物的含量有所上升,分別為8.7 g/100 g和18.96 g/100 g。白耙齒菌組酒糟成分的變化程度最大,酒糟中粗脂肪、粗纖維、粗灰分和淀粉含量下降明顯,分別為0.61 g/100 g、2.76 g/100 g、2.08 g/100 g和5.17 g/100 g,與原酒糟相比,白耙齒菌組酒糟的粗脂肪和淀粉含量分別下降78.97%和62.18%;粗蛋白和無氮浸出物的含量分別上升了10.69%和60.55%,達(dá)到9.32 g/100 g和25.8 g/100 g。
原酒糟中多糖、還原糖和金屬硫蛋白的含量分別為520.00mg/100g、200.00mg/100g和5.80mg/100g,白耙齒菌組酒糟的多糖、還原糖含量均比原酒糟低,分別為86.41mg/100 g、62.50 mg/100 g,金屬硫蛋白含量變化不大,為5.90 mg/100 g而酵母組中多糖含量為630.00 mg/100 g,上升21.15%,但還原糖含量卻下降至140.00 mg/100 g,金屬硫蛋白含量上升至6.80 mg/100 g。
在醬香型白酒生產(chǎn)過程中,控制原料的適宜參數(shù),如水分、粗蛋白和淀粉含量等是生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵點(diǎn)之一。本試驗(yàn)所用的粹沙酒糟與茅臺酒糟[19]相比,除水分含量和無氮浸出物含量稍高,其余理化指標(biāo)均低于茅臺酒糟,其原因可能是發(fā)酵原料種類、配比和生產(chǎn)工藝的不同,造成固態(tài)發(fā)酵白酒酒糟的營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量的差異[1]。金屬硫蛋白是微生物與動植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白[20],其在保健品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣泛,因此在研究開發(fā)酒糟丟糟產(chǎn)品用于生產(chǎn)保健品時(shí),企業(yè)要求將此項(xiàng)指標(biāo)考慮在內(nèi)。本試驗(yàn)中酵母組的金屬硫蛋白含量有所上升,其原因可能是酵母組中細(xì)菌和酵母的生物量遠(yuǎn)高于其余兩組,而在本試驗(yàn)中金屬硫蛋白主要來源于微生物,因此推測金屬硫蛋白含量的升高可能與酵母組中的生物量有關(guān),但確切的原因還需進(jìn)一步研究。綜上所述,試驗(yàn)中所用畢赤酵母和白耙齒菌均能夠改善酒糟的品質(zhì),但兩者之間也存在差異,這與游玲等[21]的研究結(jié)果一致。白耙齒菌對酒糟品質(zhì)的改善效果優(yōu)于畢赤酵母,但金屬硫蛋白含量低于畢赤酵母組,因此,在后續(xù)醬香型酒糟產(chǎn)品開發(fā)時(shí)可以考慮將兩者結(jié)合,進(jìn)行混菌發(fā)酵。
由表2可知,原酒糟中共檢出54種揮發(fā)性成分,其中酯類29種、醛類8種、醇類6種、酸類3種、酚類和酮類各1種、烷類和其他類各2種;構(gòu)成原酒糟中揮發(fā)性成分的物質(zhì)主要是酯類(47.3%)、醇類(27.7%)和酸類(13.4%)。酵母組中揮發(fā)性成分共檢出44種,其中酯類28種、醛類7種、醇類6種、酚類、酸類和其他類各1種;構(gòu)成其揮發(fā)性成分主體物質(zhì)是酯類(57.9%)和醇類(30.9%)。白耙齒菌組共檢出37種揮發(fā)性成分,其中烯類23種、醛類6種、醇類3種、酮類2種、酯類和酚類各1種;其揮發(fā)性成分主體物質(zhì)是烯類(48.7%)、其他類(22.1%)和酮類(13.1%)。
表2 酒糟發(fā)酵前后揮發(fā)性成分相對含量Table 2 Relative contents of volatile components in distiller's grains before and after fermentation%
續(xù)表
續(xù)表
發(fā)酵后的酒糟中揮發(fā)性成分的種類和含量各不相同,其中原酒糟中揮發(fā)性成分最多,酵母組次之,白耙齒菌組中最少。并且各試驗(yàn)組中揮發(fā)性成分主體物質(zhì)也存在一定差異,原酒糟和酵母組中揮發(fā)性成分主體物質(zhì)均含有酯類和醇類,在檢出的酯類物質(zhì)中,乙酯類含量和種類最多,可能與酵母種類和酶活相關(guān)[22],這與王軒等[23]的結(jié)果一致。而白耙齒菌組的揮發(fā)性成分主體為烯類,這與楊建遠(yuǎn)等[24]的結(jié)果不一致,后者揮發(fā)性主體物質(zhì)為酯類(42.41%),但兩者都具有濃郁的香氣,這可能是因?yàn)閮烧咚迷喜煌隆0装引X菌組的揮發(fā)性成分雖然比酵母組少,但其揮發(fā)性成分主要為烯類物質(zhì),其中含量較大的有(-)-馬兜鈴烯(10.64%)、α-愈創(chuàng)木烯(9.38%)和(+)-苜蓿烯(8.17%)等,萜烯類物質(zhì)普遍具有較強(qiáng)的抗菌活性、止痛能力和抗氧化活性等功能[25],說明白耙齒菌發(fā)酵后的酒糟更具應(yīng)用價(jià)值,更適合用于醬香型酒糟產(chǎn)品的開發(fā)。
本研究結(jié)果表明,白耙齒菌組微生物的種類和數(shù)量最多,共檢測出細(xì)菌、酵母和霉菌三種微生物,酵母組次之,但未檢出霉菌,原酒糟中最少,只檢出細(xì)菌;白耙齒菌和酵母均能利用酒糟的營養(yǎng)成分進(jìn)行生長和代謝,且前者對于酒糟的利用程度優(yōu)于后者,兩株菌均能在一定程度上改善酒糟的品質(zhì);原酒糟、酵母組和白耙齒菌組分別檢測出54種、44種和37種揮發(fā)性成分,且相對含量逐漸減少,原酒糟和酵母組的主要揮發(fā)性成分是酯類和醇類,而白耙齒菌組的揮發(fā)性成分主要是烯類?;诰圃闫焚|(zhì)改善效果和揮發(fā)性成分測定結(jié)果,建議在后續(xù)醬香型酒糟發(fā)酵處理時(shí),采用兩者結(jié)合進(jìn)行混菌發(fā)酵。本研究為后續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化處理提供了數(shù)據(jù)支撐。