孔令紅，萬(wàn)智毅，劉曉剛

清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院病理科，北京 100022

卵巢癌的發(fā)病率在全部婦科惡性腫瘤中居第三位，但致死率最高。據(jù)2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)每年有5.21萬(wàn)人被診斷為卵巢癌，2.25萬(wàn)人死于卵巢癌。卵巢癌具有很高的異質(zhì)性，約90%屬于上皮性卵巢癌，其中約70%為漿液性，預(yù)后較差。早期（Ⅰ期）卵巢癌患者的5年生存率超過90%，然而早期卵巢癌無(wú)明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者很難在早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，70%以上的卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，5年生存率不足70%。卵巢癌異質(zhì)性強(qiáng)、進(jìn)展較快、缺乏合適的早期檢測(cè)方法是卵巢癌早期檢測(cè)的重要挑戰(zhàn)。因此，尋找可靠的卵巢癌早期檢測(cè)標(biāo)志物具有十分重要的意義。目前，血清糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是臨床中使用最廣泛的上皮性卵巢癌診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物。但在早期卵巢癌患者中，其靈敏度不到50%，且特異度不高。很多疾病患者的血清中CA125水平都會(huì)升高，如子宮內(nèi)膜異位、腹膜炎、盆腔炎、子宮肌瘤、肝硬化等，在肺癌與結(jié)直腸癌中CA125的表達(dá)水平也會(huì)升高。因此，單獨(dú)檢測(cè)CA125并不適合用于上皮性卵巢癌的早期診斷。美國(guó)一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)[前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌（Prostate,Lung,Colorectal and Ovarian，PLCO）篩查試驗(yàn)]結(jié)果表明，與常規(guī)護(hù)理組（不接受CA125與陰道超聲年度篩查但進(jìn)行常規(guī)的醫(yī)療護(hù)理）相比，結(jié)合陰道超聲和CA125進(jìn)行卵巢癌篩查并不能降低卵巢癌的致死率。英國(guó)的卵巢癌篩查試驗(yàn)應(yīng)用陰道超聲與CA125篩查了20萬(wàn)無(wú)癥狀的絕經(jīng)后女性，發(fā)現(xiàn)CA125結(jié)合陰道超聲檢測(cè)盡管提高了特異度（99.8%），但是并未顯著提高靈敏度。類似于PLCO研究，該研究的隨訪數(shù)據(jù)表明陰道超聲結(jié)合CA125檢測(cè)并未顯著降低卵巢癌的致死率。一些研究應(yīng)用CA125聯(lián)合其他血清腫瘤標(biāo)志物診斷卵巢癌，雖然提高了靈敏度與特異度，但仍不能滿足卵巢癌篩查的需求。其中非常有前景的組合是人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）聯(lián)合CA125檢測(cè)，但目前美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）僅批準(zhǔn)其用于卵巢癌的復(fù)發(fā)或進(jìn)展監(jiān)測(cè)。至今臨床上并未建立適用于早期卵巢癌檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物組合，仍需要大量的研究與驗(yàn)證。本文就卵巢癌早期檢測(cè)的DNA甲基化標(biāo)志物研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA突變標(biāo)志物

癌癥基因組研究表明腫瘤細(xì)胞的基因組存在大量的遺傳變異。在卵巢癌中，大部分樣本都存在腫瘤蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）基因突變，集中在4～10號(hào)外顯子。通過檢測(cè)血漿中的循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）可檢測(cè)出這些DNA突變。在cfDNA中，一部分為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），它是由腫瘤細(xì)胞通過凋亡、壞死等方式釋放到血液循環(huán)中的DNA片段，攜帶了腫瘤細(xì)胞特異的遺傳及表觀遺傳信息，因此可以用于腫瘤的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。一些研究嘗試通過檢測(cè)血漿、腹腔積液、卵巢囊腫積液等體液中的ctDNA突變進(jìn)行卵巢癌檢測(cè)。Krimmel等通過高深度測(cè)序在卵巢癌患者的腹腔積液中檢測(cè)出低頻

TP53

突變，然而在健康人的對(duì)照樣本中也能檢出非常低頻的

TP53

突變。CancerSEEK試驗(yàn)是一個(gè)多中心臨床試驗(yàn)，通過ctDNA結(jié)合蛋白標(biāo)志物檢測(cè)8種惡性腫瘤，結(jié)果顯示，其在保證特異度為99%的同時(shí)，對(duì)卵巢癌患者的檢測(cè)達(dá)到了98%的靈敏度，然而大部分患者為晚期患者，只有9例患者為Ⅰ期。早期卵巢癌的ctDNA突變檢出率明顯低于晚期，即使ctDNA的測(cè)序深度在3萬(wàn)乘以上，早期（Ⅰ/Ⅱ期）卵巢癌檢測(cè)的靈敏度也不足68%。根據(jù)GRAIL公司開展的大型隊(duì)列研究——循環(huán)游離基因組圖譜研究（the circulating cell-free genome atlas，CCGA）初步報(bào)道的結(jié)果，在達(dá)到99%特異度時(shí)，即使ctDNA的測(cè)序深度達(dá)到6萬(wàn)乘，Ⅰ～Ⅲ期卵巢癌檢測(cè)的靈敏度也只有67%。由此可見，通過檢測(cè)ctDNA突變來進(jìn)行早期卵巢癌的檢測(cè)達(dá)不到較高的靈敏度，并不是進(jìn)行卵巢癌早期檢測(cè)的理想途徑。其原因在于卵巢癌本身的異質(zhì)性，并不是所有的卵巢癌組織都存在DNA突變。根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，81%的卵巢癌組織樣本中存在驅(qū)動(dòng)基因變異；而在高級(jí)別漿液性卵巢癌中，只有73%的患者存在

TP53

突變。ctDNA突變檢測(cè)早期卵巢癌的靈敏度不高還可能是由于早期卵巢癌患者的血漿中ctDNA含量很低，有限的血液樣本（一般10 ml）很可能檢測(cè)不到帶有突變信息的DNA片段。另外，DNA突變信息不具備組織特異性，容易受其他腫瘤及疾病的干擾。以TP53為例，很多類型的惡性腫瘤中都存在

TP53

突變，甚至很多非惡性腫瘤人群的體液中也存在低水平的

TP53

突變。最后，高深度測(cè)序產(chǎn)生的較高成本也是限制該方法在臨床中應(yīng)用的重要因素。

2 DNA甲基化標(biāo)志物

與DNA突變不同，DNA甲基化修飾具有組織特異性、變化范圍廣、潛在靈敏度高等特點(diǎn)，長(zhǎng)久以來被認(rèn)為非常適合作為惡性腫瘤早期檢測(cè)的標(biāo)志物。DNA甲基化是表觀遺傳修飾途徑之一，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA穩(wěn)定性發(fā)生改變，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要聯(lián)系。在惡性腫瘤發(fā)生之前的癌前病變階段，相較于正常組織細(xì)胞，病變組織細(xì)胞的基因組已經(jīng)產(chǎn)生了廣泛的DNA甲基化修飾。因此，相對(duì)于DNA突變而言，DNA甲基化修飾是腫瘤發(fā)生的最早期事件，具有更高的靈敏度與特異度，更適合作為診斷的標(biāo)志物。在卵巢癌細(xì)胞中，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3（forkhead box D3，F(xiàn)OXD3）的高甲基化與腫瘤生長(zhǎng)抑制有關(guān)。部分卵巢癌中乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）的沉默也是由其啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致的。除此之外，很多其他基因的表達(dá)也由于啟動(dòng)子區(qū)的甲基化而受到抑制，包括

DAPK

、

LOT1

、

HOXA10

、

HOXA11

、

CTGF

、

TMS1/ASC

、

PAR4

、

p16

、

SPARC

、

CDH1

、

SFN

、

WT1

等。Melnikov等通過高通量測(cè)序方法比較了卵巢癌組織與正常組織的差異甲基化區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包括

BRCA1

、

MLH1

在內(nèi)的10個(gè)基因在卵巢癌組織中高度甲基化，這些基因的組合最高可以達(dá)到69%的靈敏度與70%的特異度，然而這些卵巢癌組織樣本集中于晚期，其對(duì)早期卵巢癌的診斷能力并不明確。盡管許多研究報(bào)道了卵巢癌組織中特異的DNA甲基化標(biāo)志物，然而臨床中早期卵巢癌的檢測(cè)只有通過體液等無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)方式才具有可行性。一些研究已經(jīng)報(bào)道了用于卵巢癌早期檢測(cè)的血漿DNA甲基化標(biāo)志物（表1），例如

BRCA1

、

OPCML

、

RASSF1A

、

ESR1

等。Ibanez de Caceres等首次報(bào)道了檢測(cè)血漿中ctDNA甲基化進(jìn)行卵巢癌診斷的可行性，通過檢測(cè)

BRCA1

、

RASSF1A

、

APC

、

p14ARF

、

p16INK4a

、

DAPK

等6個(gè)基因的甲基化水平，靈敏度為82.0%（41/50），特異度為100%（40/40）。Melnikov等采集了33例中晚期卵巢癌患者與33例健康對(duì)照者的血漿樣本，通過檢測(cè)

BRCA1

、

HIC1

、

PAX5

、

PGR

、

THBS1

等5個(gè)基因的甲基化水平，達(dá)到了85.1%的靈敏度，然而特異度只有61.1%。也有研究?jī)H檢測(cè)了卵巢癌患者、卵巢良性腫瘤患者和健康對(duì)照者的

OPCML

甲基化水平，也實(shí)現(xiàn)了非常高的靈敏度與特異度。Giannopoulou等采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylationspecificPCR，MSP）分別檢測(cè)

RASSF1A

和

ESR1

啟動(dòng)子的甲基化水平，檢出高級(jí)別漿液性卵巢癌的靈敏度分別為62.3%與38.0%。Zhang等采用多重 MSP檢測(cè)

APC

、

RASSF1A

、

CDH1

、

RUNX3

、

TFPI2

、

SFRP5

、

OPCML

等7個(gè)基因的甲基化區(qū)域，在41例Ⅰ期上皮性卵巢癌患者的血漿中獲得85.3%的靈敏度和90.5%的特異度。Widschwendter等報(bào)道了一個(gè)與

COL23A1

、

C2CD4D

、

WNT6

相關(guān)的3個(gè)甲基化標(biāo)志物組合，通過高通量測(cè)序檢測(cè)血漿中的cfDNA來區(qū)分高級(jí)別漿液性卵巢癌與健康人群及卵巢良性腫瘤患者，特異度為90.7%，靈敏度為41.4%；并且檢測(cè)卵巢癌患者臨床確診前2年之內(nèi)的血漿樣本，在特異度為96.9%時(shí)，靈敏度為23.3%。

表1 卵巢癌早期檢測(cè)的DNA甲基化標(biāo)志物

從以上研究報(bào)道可以看出，整體而言，基于cfDNA甲基化檢測(cè)卵巢癌可以得到較高的特異度與靈敏度，然而不同研究中得到的靈敏度差異較大。由于這些報(bào)道基本都使用相同的MSP方法進(jìn)行檢測(cè)，所以這種差異主要是由于腫瘤的異質(zhì)性、樣本量較小引起的。整體而言，多基因/區(qū)域的甲基化檢測(cè)一般比單基因/區(qū)域的檢測(cè)得到的靈敏度更高。采用單基因/區(qū)域檢測(cè)獲得較高靈敏度的研究很難在大樣本的驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)，例如

OPCML

，其在卵巢癌組織中的高甲基化檢出率一般為33.3%～82.6%，因此，預(yù)期其在大量血漿樣本的驗(yàn)證中也得到先前報(bào)道的接近90%的靈敏度是不現(xiàn)實(shí)的。

基于cfDNA甲基化的卵巢癌早期檢測(cè)也面臨著缺乏普遍性的單個(gè)標(biāo)志物、cfDNA含量低引起的穩(wěn)定性差、靈敏度不足等問題。因此，提高卵巢癌早期檢測(cè)的準(zhǔn)確性，一方面必須檢測(cè)更多、更普遍的標(biāo)志物，另一方面必須提高其在cfDNA中檢測(cè)的靈敏度。Guo等基于基因組甲基化測(cè)序的數(shù)據(jù)定義了甲基化單倍型塊（methylation haplotype block，MHB），并通過檢測(cè)和分析cfDNA中的MHB信息進(jìn)行惡性腫瘤的早期檢測(cè)與組織溯源，其信噪比遠(yuǎn)高于平均甲基化水平分析等方法。該方法稱為基于甲基化單體型的非侵入性診斷（methylation haplotyping for non-invasive diagnosis，MONOD）技術(shù)，通過高通量測(cè)序覆蓋全基因組400萬(wàn)個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)，分析和篩選不同cfDNA樣本間差異的MHB。Hong等應(yīng)用該方法檢測(cè)cfDNA進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別，靈敏度達(dá)到87.0%，特異度為84.2%。Liu等應(yīng)用該方法檢測(cè)cfDNA進(jìn)行胰腺癌的早期檢測(cè)，靈敏度達(dá)到68.4%，特異度為90.4%。研究顯示，利用該技術(shù)可在血漿樣本中檢出結(jié)直腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、胃癌的cfDNA甲基化信號(hào)，整體特異度為96%，靈敏度達(dá)到88%，甚至在臨床確診前4年的血漿樣本中也檢出了惡性腫瘤信號(hào)。另外，Xu等應(yīng)用類似的方法檢測(cè)cfDNA進(jìn)行肝癌檢測(cè)，靈敏度＞83%，特異度＞90%。在腸癌的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)研究中，類似的方法也取得不錯(cuò)的效果，靈敏度為87.9%，特異度為89.6%。

3 小結(jié)

綜上所述，由于DNA甲基化具有更好的組織特異性，發(fā)生改變的時(shí)期更早、范圍更廣，因此較DNA突變更適合作為惡性腫瘤早期檢測(cè)的標(biāo)志物。很多研究已經(jīng)報(bào)道了卵巢癌相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)志物?；贛HB的檢測(cè)方法檢測(cè)范圍廣、信噪比高，比較適合cfDNA等微量樣本的檢測(cè)，尤其適合惡性腫瘤的早期檢測(cè)，能夠獲得較高的靈敏度與特異度。隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，基于MHB的多靶點(diǎn)測(cè)序已經(jīng)在腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤的早期檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)比較理想的靈敏度與特異度。因此，利用基于MHB的多靶點(diǎn)檢測(cè)進(jìn)行卵巢癌的早期診斷非常值得探索。