張勇，張煒，范崇盛

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河南 洛陽 471000

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，盡管手術(shù)對喉癌的療效已被證實(shí)，但術(shù)后復(fù)發(fā)仍是臨床面臨的棘手問題。雖然尋找預(yù)測喉癌患者預(yù)后的指標(biāo)非常重要，但尚未發(fā)現(xiàn)可以預(yù)測喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況的特異性標(biāo)志物。p21可以減少受損的DNA復(fù)制，防止異常細(xì)胞增殖，從而抑制惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，p21可能是抑癌基因，但在某些條件下，其可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，并具有致癌性，其表達(dá)主要取決于細(xì)胞環(huán)境。Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）參與了多種器官的生長和細(xì)胞的增殖過程，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。關(guān)于腫瘤組織中p21表達(dá)情況的研究已有報道，但關(guān)于p21和YAP同時表達(dá)情況的研究報道很少。本研究初步探討喉癌組織中p21、YAP蛋白的表達(dá)情況與喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2017年4月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院行手術(shù)治療的喉癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2014年版《喉癌外科手術(shù)及綜合治療專家共識》中關(guān)于喉癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②術(shù)前經(jīng)喉鏡、CT、MRI檢查確診，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；③術(shù)前未接受放化療、免疫學(xué)治療；④年齡為19～79歲：⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性喉癌；②有放化療史；③長期使用免疫抑制劑。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入118例喉癌患者，根據(jù)復(fù)發(fā)情況分為復(fù)發(fā)組（

n

=47）、非復(fù)發(fā)組（

n

=68）和失訪患者3例。復(fù)發(fā)組中，男41例，女6例；年齡51～79歲，平均（64.8±6.2）歲。非復(fù)發(fā)組中，男57例，女11例；年齡44～79歲，平均（63.3±7.8）歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化染色法

切除整塊腫瘤后，留取喉癌病灶組織，將所取標(biāo)本置于4%中性甲醛中固定，常規(guī)制作組織石蠟切片，并進(jìn)行常規(guī)免疫組化處理，滴加一抗4℃孵育過夜，一抗的工作濃度為1∶100，孵育后，第2天采用磷酸鹽緩沖液洗滌切片，清洗3次，每次10 min，然后滴加二抗進(jìn)行孵育1 h，再依次進(jìn)行SABC孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色等，最后使用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。選擇YAP和p21表達(dá)陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。觀察細(xì)胞的陽性表達(dá)情況。兩種蛋白的一抗、二抗均購自美國Invitrogen公司。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

p21、YAP蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，陽性染色呈黃色、棕黃色、褐色。依據(jù)染色強(qiáng)度評分：未染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，褐色、黑色計(jì)3分。依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分：陽性細(xì)胞所占百分比≤10%，計(jì)1分；陽性細(xì)胞所占百分比為11%～50%，計(jì)2分；陽性細(xì)胞所占百分比為51%～75%，計(jì)3分；陽性細(xì)胞所占百分比＞75%，計(jì)4分。染色程度與陽性細(xì)胞所占百分比評分相乘，總分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 p21、YAP蛋白在喉癌組織中陽性表達(dá)情況的比較

復(fù)發(fā)組患者喉癌組織中p21蛋白的陽性表達(dá)率為23.40%（11/47），明顯低于非復(fù)發(fā)組患者的51.47%（35/68），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=9.122，

P

＜0.01）；復(fù)發(fā)組患者喉癌組織中YAP蛋白的的陽性表達(dá)率為80.85%（38/47），明顯高于非復(fù)發(fā)組患者的57.35%（39/68），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=6.936，

P

＜0.01）。

2.2 喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況的單因素分析

兩組患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、病灶部位、術(shù)后化療情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；復(fù)發(fā)組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比例均高于非復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 115例喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況影響因素的單因素分析*

2.3 喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況影響因素的多因素分析

以TNM分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、p21蛋白表達(dá)情況、YAP蛋白表達(dá)情況作為自變量，以術(shù)后3年復(fù)發(fā)情況作為因變量，納入Logistic回歸分析模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，TNM分期高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、YAP蛋白陽性表達(dá)均是喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，p21蛋白陽性表達(dá)率升高是喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素（

P

＜0.05）。（表2）

表2 115例喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

喉癌是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，由于一系列原因，其發(fā)病率不斷升高，臨床治療方法亦不斷改進(jìn)，同時，患者的術(shù)后復(fù)發(fā)情況受到廣泛重視，但關(guān)于喉癌患者術(shù)后檢測的特異性指標(biāo)臨床尚存在爭議。

Hippo信號通路的作用體現(xiàn)在維持機(jī)體生理功能穩(wěn)態(tài)的各個方面，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中亦發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。YAP蛋白是Hippo信號通路中的主要效應(yīng)因子，位于人染色體11q22。有研究發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白在許多腫瘤中均異常高表達(dá)，并能預(yù)示腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組患者喉癌組織中YAP蛋白的的陽性表達(dá)率明顯高于非復(fù)發(fā)組（

P

＜0.01），另外，TNM分期高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、YAP蛋白陽性表達(dá)均是喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素（

P

＜0.05）。原因是YAP蛋白在喉癌中的表達(dá)可能具有積極的調(diào)節(jié)作用。WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)其他因素作用于WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時，WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中B-catenin的降解過程受到抑制，細(xì)胞中B-catenin水平很高，其進(jìn)入細(xì)胞核后，激活下游靶基因，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，WNT與Hippo信號通路具有協(xié)同作用。因此，推測Hippo和WNT信號通路通過YAP和B-catenin的協(xié)同作用，促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的增殖，使喉癌細(xì)胞于術(shù)后易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，增加了術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，但由于本研究的樣本數(shù)量有限，仍需加大樣本量進(jìn)一步探討。p21蛋白是一種可調(diào)控細(xì)胞周期的抑制蛋白，對DNA的損傷修復(fù)具有一定影響。p21還能抑制CDK復(fù)合物的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞停滯于G期，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。p21阻滯了各種應(yīng)激環(huán)境下的細(xì)胞周期，并在腫瘤抑制信號通路中發(fā)揮抗增殖效應(yīng)，從而抑制細(xì)胞增殖。然而，在某些條件下，p21可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和致癌性，其表達(dá)情況主要取決于細(xì)胞環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組患者喉癌組織中p21蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于非復(fù)發(fā)組（

P

＜0.01）；p21蛋白陽性表達(dá)率升高是喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的保護(hù)性因素（

P

＜0.05）。分析其原因是p53的激活可導(dǎo)致下游產(chǎn)物p21的過表達(dá)，從而通過滅活CDK2阻止了細(xì)胞周期的進(jìn)程。p21分子具有與p53的結(jié)合區(qū)，惡性腫瘤組織中p53突變體的表達(dá)可刺激p21的異常表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡化。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中p21的表達(dá)存在細(xì)胞異質(zhì)性，p21蛋白的穩(wěn)定性良好，易出現(xiàn)蛋白積累。p21的C端和N端可以與某些部分相互作用，其水平隨著細(xì)胞增殖周期的變化而變化，可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。p21過表達(dá)表明細(xì)胞已在分子水平發(fā)生了改變，這種改變通常先表現(xiàn)于細(xì)胞形態(tài)，這可能是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的原因之一，并且是預(yù)后預(yù)測的關(guān)鍵生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，喉癌組織中p21蛋白表達(dá)水平的降低、YAP蛋白表達(dá)水平的升高可能會增加喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險。另外，TNM分期高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、YAP蛋白陽性表達(dá)均是喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，p21蛋白陽性表達(dá)率升高是喉癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立保護(hù)因素。p21和YAP蛋白的表達(dá)情況可為喉癌的預(yù)后預(yù)測提供參考，并認(rèn)為其分子結(jié)構(gòu)水平的異常表達(dá)可用于疾病的預(yù)后判斷。本研究的不足之處在于未對陽性指標(biāo)進(jìn)行跟進(jìn)，在今后的研究中需要對陽性表達(dá)的患者采取有效的預(yù)測性對癥干預(yù)措施。