張志東, 顧美英, 唐琦勇, 楚敏, 朱靜, 孫建, 楊蓉, 徐萬里

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所, 新疆特殊環(huán)境微生物實驗室, 烏魯木齊 830091;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所, 烏魯木齊 830091)

新疆鹽堿土地分布廣，鹽堿化種類多樣，被稱為世界鹽堿土的博物館[1]。同時，由于長期耕作管理不當，以及當前膜下滴灌模式的采用，近50% 宜耕土地受不同程度鹽漬化和次生鹽漬化的威脅，嚴重影響了作物生長發(fā)育及產(chǎn)量。如何利用新技術(shù)、新方法有效減緩鹽漬化對農(nóng)業(yè)作物的影響，推動新疆農(nóng)業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展，已成為科研工作者亟待解決的重大課題[2-3]。

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobateria, PGPR)是指生存在植物根際或根表，直接或間接促進或調(diào)節(jié)植物生長的一類微生物菌群[4]。相關(guān)研究表明，根際細菌在共同適應(yīng)和進化過程中，能夠通過多種機制促進植物生長，一方面可通過產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)劑來直接促進作物生長，也可以通過其固氮、溶磷、解鉀的作用轉(zhuǎn)化土壤中礦物質(zhì)，以促進植物相關(guān)營養(yǎng)元素的吸收利用[4-7]；另一方面，根際細菌也可通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，以增強植物的抗逆特性[8-9]。同時，PGPR代謝活動能夠增強土壤中有機物的分解，促進植物營養(yǎng)元素的礦化，改良土壤結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)成分，提高土壤肥力[10-12]。國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者已對多種農(nóng)作物如煙草、棉花、花生等開展植物根際促生細菌研究，結(jié)果表明，PGPR在農(nóng)作物防病、增產(chǎn)中具有重要作用[12-15]。同時，在荒漠耐鹽植物根際耐鹽促生菌方面也有研究[13]，為利用相關(guān)菌株提高農(nóng)作物耐鹽性、促生長、開發(fā)相關(guān)菌劑提供了理論依據(jù)。

新疆地區(qū)鹽生植物種類多、分布廣，其中藜科多年生灌木鹽爪爪[Kalidiumfoliatum(Pall.)Moq]是典型的鹽生植物，廣泛分布在鹽堿荒漠生境，具有較強抗逆特性。前期研究表明，鹽爪爪根際存在豐富的耐鹽微生物，部分菌株具有產(chǎn)生吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)和解磷等植物促生作用[14]。因此，進一步開展鹽爪爪根際微生物耐鹽促生菌的研究，將有利于相關(guān)微生物菌肥的研制，進而為新疆鹽漬土地的治理開發(fā)提供新技術(shù)和新方法。本研究以鹽爪爪根際微生物為研究對象，開展了其耐鹽促生細菌的分離鑒定及促生特性分析，并進行了棉花盆栽效果驗證試驗，旨在為進一步篩選和復(fù)配耐鹽促生菌肥提供科學(xué)依據(jù)和前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 鹽爪爪于2016年4月采自新疆和碩地區(qū)。供試棉種為陸地棉新陸中42號，購自新疆明珠花卉市場。

1.1.2培養(yǎng)基 解磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NBRIP培養(yǎng)基)、Ashby培養(yǎng)基、硅酸鹽細菌培養(yǎng)基、Pikovskaya’s培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基等，均由青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。DF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基參照許芳芳[13]的方法配制。上述培養(yǎng)基在滅菌使用前，均另加2% NaCl。

1.2 試驗方法

1.2.1根際土壤的收集 鹽爪爪植株樣品采用垂直挖掘法，盡可能保證根部的完整性。選擇完整植株根部，采用抖落法去除非根際土壤，并在無菌條件下，利用無菌細毛刷輕刷根部，收集根際土壤樣品。土樣充分混合后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，于4 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2PGPR菌株的分離 在超凈工作臺中稱取5 g鹽爪爪根際土樣，加入裝有50 mL 2% NaCl無菌溶液的三角瓶中。30 ℃、120 r·min-1振蕩 0.5 h，靜置10 min。吸取上述懸液1 mL，經(jīng)適度梯度稀釋后，涂布至含有2% NaCl的分離培養(yǎng)基平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3～15 d，待菌落長出后，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色等進行初步篩選，分離純化后，接至2% NaCl R2A培養(yǎng)基斜面上，4 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.3菌株的分子鑒定 使用菌落PCR法，采用細菌16S rDNA序列通用引物27 F和1 492 R擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，送往北京鼎國生物技術(shù)有限公司進行測序。所得序列經(jīng)手工校對后，上傳至EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)數(shù)據(jù)庫進行比對，并調(diào)取相關(guān)同源性最高模式菌株序列, 使用MEGA 5.0進行CLUSTAL X多重比對[15]，并使用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值(Bootstrap)為1 000，初步確定菌株的生物學(xué)分類地位。

1.2.4菌株耐受性測定 選取各屬種代表性的14株菌株進行耐鹽促生實驗，菌株接種于含有2% NaCl的1/10 TSA液體培養(yǎng)基中，分別采用10和45 ℃恒溫培養(yǎng)，確定其低溫和高溫生長情況。菌株接種于含有10% NaCl的1/10 TSA培養(yǎng)基中，于 30 ℃恒溫培養(yǎng)3～15 d，連續(xù)觀察并進行耐鹽特性統(tǒng)計[14]。

1.2.5解磷和固氮能力測定 將14株代表性菌株點植到改良PKO 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值大小初步判斷菌株溶磷能力的強弱。菌株的固氮特性以菌株在Ashby培養(yǎng)基上生長，初步確定為固氮陽性[13]。

1.2.6ACC脫氨酶陽性菌篩選 參考Penrose等[16]的方法，將14株代表性菌株接種至液體無氮培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。吸取培養(yǎng)液0.1 mL 接種至5 mL DF液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h。吸取上述培養(yǎng)液0.1 mL接種至ADF液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h后，重復(fù)轉(zhuǎn)接ADF培養(yǎng)基中，能生長的菌株判定為ACC脫氨酶陽性菌株。

1.2.7IAA產(chǎn)生能力測定 將待測菌株接種含有2% NaCl的1/10 TSA液體培養(yǎng)基，于120 r·min-1、30 ℃ 恒溫震蕩培養(yǎng)5 d。取菌液，10 000 r·min-1離心15 min，每1 mL上清液加0.5 mL Salkowski 試劑。室溫暗處顯色1 h 后，于530 nm處測OD值[17]。以空白培養(yǎng)基作對照，并以IAA標準曲線計算發(fā)酵液中IAA濃度。

1.2.8棉花促生的穴盤驗證試驗 菌株通過相關(guān)促生定性定量分析后，選取12株代表性菌株進行盆栽驗證。采用4×5穴的穴栽盤，以水洗黃沙烘干后為穴栽土壤。土壤用5% NaCl溶液浸潤后，添加過夜放置自來水并混勻，最終使土壤含水量達到50%，含鹽量達到0.75%。選擇顆粒飽滿且無明顯破損的棉種，使用0.1%的升汞消毒5 min，無菌水洗凈后，浸于1/100濃度菌液4 h后，點植入穴栽盤，每穴為4粒，深度約1.5 cm，放置于人工氣候箱培養(yǎng)，光照強度24 000 lx，光照時間14 h·d-1，光照時溫度控制到30 ℃，無光照時溫度控制到25 ℃，濕度控制為40%。每種菌劑處理重復(fù)4穴，以在清水浸泡為對照1(CK1)，并以清水浸泡點植于無鹽土壤中為對照0(CK0)，每天用過夜放置自來水噴灑2次。待發(fā)芽后，每隔5 d澆灌一次(每穴約10 mL)。待發(fā)芽20 d后，測量各試驗組和對照組棉花植株的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)，包括發(fā)芽率、株高、根長、干重等[18-19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Office Excel 2003軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽爪爪PGPR菌株的分離與鑒定

2.1.1鹽爪爪PGPR菌株分離純化 培養(yǎng)3～15 d后，通過觀察菌落形態(tài)，共挑取各類菌株74株。通過進一步分離純化，菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察去重后，共獲得試驗菌株57株。所得菌株保存至2% NaCl的R2A斜面上，用于進一步實驗分析。

2.1.2鹽爪爪PGPR菌株多樣性分析 由圖1可知，鹽爪爪根際PGPR菌株存在豐富的多樣性，所得菌株共歸屬在4個門12個屬。其中，放線菌門(Actinobacteria)所含菌屬最多，共涉及6個屬；其次為變形桿菌門(Proteobacteria)，涉及3個屬；再次為厚壁菌門(Firmicutes)，涉及2個屬；擬芽孢桿菌(Bacteroidetes)最少，僅涉及Sinomicrobium屬。

圖1 基于菌株16S rDNA序列的NJ進化樹

2.2 菌株耐鹽促生分析結(jié)果

表1顯示，經(jīng)測試，86%的試驗菌株具有耐受10% NaCl的能力，50%的菌株具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力，50%的菌株具有解無機磷能力，42.8%具有固氮能力，86%的菌株具有產(chǎn)IAA的能力。其中，菌株CM7產(chǎn)IAA能力最強，最高可達45.32 mg·L-1(圖2)，展現(xiàn)了鹽爪爪根際PGPR菌株在耐鹽促生中應(yīng)用前景。

圖2 典型菌株產(chǎn)IAA的測定結(jié)果

表1 典型菌株耐鹽及促生特性分析結(jié)果

2.3 棉花穴栽盤驗證試驗結(jié)果

2.3.1菌株對棉花發(fā)芽率和干重的影響 從圖3可以看出，鹽分對棉花發(fā)芽率有明顯的抑制作用，與正常發(fā)芽率95%相比，試驗條件下未加菌液處理的棉種發(fā)芽率幾乎降低了一半，僅為50%左右，但對成活棉株的平均干重影響不明顯。多數(shù)試驗菌株處理可提高棉種在鹽脅迫下的發(fā)芽率，其中接種菌株R11提高最為明顯，發(fā)芽率達到75%，較未接種菌液處理發(fā)芽率最高可以提高25%；其次為菌株K18，其發(fā)芽率可以提高65%；其他菌株提高不明顯。而添加了MM18后，發(fā)芽率反而下降，僅為35%。干重數(shù)據(jù)顯示，以CK1處理的干重為基準，添加R11、K27、CM7等菌株處理后，棉株干重明顯提高，其中CM7處理最為明顯，干重較CK1處理提高了22.1%；而T25、K18等菌株處理對干重增加不明顯；菌株Y24處理后，棉株干重反而下降。

圖3 菌株處理對棉花發(fā)芽率和棉株干重的影響

2.3.2菌株處理對棉花株高和根長的影響 圖4顯示，試驗菌株處理可以有效提高棉苗根的生長，在出芽后3 d，與CK1比較，菌株處理后的棉苗根系生長即有明顯變化，其中R11、T25、K18等菌株處理后根系生長較好。進一步培養(yǎng)至20 d后，不同處理間根系差異更為明顯(圖5)，其中R11提高最為顯著，與CK1相比提高了135.2%。棉苗株高結(jié)果(圖6)也表明，菌株處理可以有效提高棉株生長，與CK1比較，R11、Y24、H9、T25、K18等菌株處理后，株高明顯提高，其中R11提高最為明顯，較CK1提高了46.1%。

圖4 典型菌株處理下棉花發(fā)芽3 d后的生長情況

注:不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有顯著性。

注:不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有顯著性。

3 討論

已有研究表明，PGPR可有效提高種子萌發(fā)率、促進根系生長、增加植物干重，特別是其定殖能力強，對根部的病原物具有抑制作用，是現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)、生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展中化肥、農(nóng)藥的理想替代品。目前，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者已從多種植物根際分離到豐富多樣的根際，如芽孢桿菌屬[7,8,12]、假單胞菌屬[9,13,18]、腸桿菌屬[13-14]、土壤桿菌屬[14]、德氏菌屬[10,19]、克雷伯氏菌屬[19]、固氮菌屬[4,19]等菌株。本研究中，從鹽爪爪根際微生物中，分離到在4個門12個屬21個種，多數(shù)菌株具有根際促生作用，其中，如Isoptericola、Sinomicrobium等屬此前鮮有相關(guān)報道，也暗示鹽生植物中可能蘊藏著豐富的尚未開發(fā)利用根際促生微生物，有待進一步挖掘。

一般而言，高濃度鹽分對植物生長有不同程度的抑制作用，但鹽生植物在長期的適應(yīng)和進化中，也形成了多種耐鹽機理，主要可分為泌鹽、拒鹽和稀鹽3種類型[20]。新疆素有世界鹽堿土博物館之稱，鹽堿種類多分布廣，耐鹽植物也多有分布。關(guān)于根際促生細菌提高植物耐鹽特性的機理主要包括誘導(dǎo)植物體內(nèi)激素變化或自身產(chǎn)生相關(guān)植物激素，如IAA等，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生滲透保護劑，產(chǎn)生胞外多糖減輕鹽脅迫，調(diào)控植物體內(nèi)離子平衡等[13,18]。同時，部分菌株具有解磷解鉀、固氮等功能，也為植物生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)，以促進植物生長，減輕鹽脅迫對植株的影響。

鹽爪爪作為典型稀鹽植物，在鹽脅迫下，植株地上和地下部分積累 Na+的程度隨著土壤環(huán)境 NaCl濃度升高而增強。同時，鹽爪爪根際土壤中多種離子濃度顯著提高，鹽分積累可在根際形成“鹽島”效應(yīng)。鹽爪爪根際存在豐富的微生物多樣性，且多數(shù)菌株呈現(xiàn)較高的耐鹽特性[14]。前期研究表明，鹽爪爪根際微生物群落活性總體呈現(xiàn)根際>根區(qū)>環(huán)境的趨勢[21]。本研究中，86%的試驗菌株具有耐受10% NaCl的能力，50%的菌株具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力，50%的菌株具有解無機磷能力，42.8%具有固氮能力，86%的菌株具有產(chǎn)IAA的能力。一方面展現(xiàn)了鹽爪爪根際存在著豐富的耐鹽促生菌株，另一方面耐鹽促生菌株有可能參與了鹽爪爪耐鹽、聚鹽等生理特性，這有待進一步深入研究。

本研究采用耐鹽促生細菌處理棉種后，通過穴栽試驗證明了R11、T25、K18等菌株處理能有效提高棉花在鹽堿脅迫下的生長。其中，菌株R11處理后植株的株高和根長提高了135.2%和46.1%，這與趙雅峰等[22]的研究結(jié)果一致，也展現(xiàn)了菌株R11在棉花促生中良好前景。同時，采用菌株Y24處理后，盡管棉株的根系和株高增加了，但其干重反而下降，可能原因是Y24具有較強的促生長作用，由于穴載培養(yǎng)營養(yǎng)不足，加之種植時間短，過度的生長反而導(dǎo)致消耗能量比較多，不利于苗期植物干物質(zhì)的增加，相關(guān)機理還需進一步驗證。此外，部分鹽爪爪根際促生菌對棉花生長的影響不明顯，甚至出現(xiàn)一定的抑制作用，這可能與相關(guān)菌株對棉花定殖效果差，或影響棉花根際正常菌群生長等有關(guān)，相關(guān)問題還有待進一步分析。同時，在進行棉花穴栽試驗時，采用水洗沙作為穴栽土壤，存在著澆水后隨著水分的蒸發(fā)，鹽分向上聚積的情況，可能造成植株所受的鹽分脅迫大于采用松軟基質(zhì)。同時，也存在水洗沙營養(yǎng)不足等情況，導(dǎo)致部分菌株處理后植株發(fā)芽率和干重增加不明顯，上述問題還將有待進一步驗證。