劉芳, 王摸云, 楊睿祺, 楊釗楠, 張平, 姚焱*

(1.廣州大學生命科學學院, 植物抗逆基因功能研究廣州市重點實驗室, 廣州 510006; 2.廣州大學化學化工學院, 廣州 510006)

鉈(thallium，Tl)是一種非必需的劇毒重金屬元素[1]。Tl元素在自然環(huán)境中以Tl(Ⅰ)和Tl(Ⅲ)兩種氧化還原狀態(tài)存在。與Tl(Ⅲ)相比，Tl(Ⅰ)在熱力學上更穩(wěn)定，是環(huán)境中Tl元素的主要存在形式。Tl是一種強烈的神經(jīng)毒物，通過食物鏈或被植物吸附進入生物體中，會產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)障礙、中毒性肝病、致突等嚴重毒性問題[2]。水稻(OryzasativaL.)是世界最重要的糧食作物之一。關(guān)注水稻Tl脅迫下Tl的吸收及耐性機制，對保障水稻正常發(fā)育和糧食的安全穩(wěn)定非常重要[3]。植物有兩種應(yīng)對重金屬脅迫的耐受機制，即外部排斥機制和內(nèi)部螯合機制。有機酸陰離子可與重金屬形成穩(wěn)定的螯合物，并降低重金屬的生物毒性，研究證明有機酸在這兩種機制中都發(fā)揮了重要作用[4]。因此，研究植物體內(nèi)有機酸的分泌和代謝機制，對于了解植物對重金屬的耐受性具有重要意義。

陰離子通道抑制劑，如9-蒽甲酸(A-9-C)、4,4′-二異硫氰酸噻吩-2, 2′-二磺酸鹽(DIDS)、尼氟酸(NIF)和苯基乙二醛(PG)，常用于研究有機酸分泌物的模式和機制。許多研究表明,特定的膜定位轉(zhuǎn)運蛋白與陰離子通道分泌的有機酸相關(guān)[5]。然而，不同陰離子通道抑制劑對不同物種具有不同的影響。此外，蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHM)在許多相應(yīng)研究中都有應(yīng)用。Yang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鋁(Al)脅迫下添加CHM對蕎麥根中的草酸分泌沒有影響，而決明子中的檸檬酸分泌則被CHM完全抑制。因此認為，在模式Ⅱ植物決明子中需要從頭合成和激活陰離子通道以促進決明子中Al誘導的檸檬酸分泌，但是在模式Ⅰ植物蕎麥中存在Al誘導下分泌草酸的質(zhì)膜蛋白(陰離子通道)。

草酸是最小的二甲酸，是鋁脅迫下蕎麥根系分泌的有機酸[7]、鉛脅迫下水稻根系分泌的有機酸[8]，也是鎘誘導下番茄和東南景天根系分泌的有機酸[9-10]的主要成分。前期研究結(jié)果表明，草酸是Tl脅迫下水稻根系分泌的特異性有機酸[11]，然而，Tl脅迫誘導的草酸分泌機制仍然未知。

本研究以水稻為研究材料，以10和25 μmol·L-1兩個Tl濃度分別處理水稻2和12 h，測定草酸分泌和植物體內(nèi)Tl含量變化，探討Tl在水稻植株中的吸收和分布特征；并通過加入陰離子通道抑制劑PG和NIF以及蛋白質(zhì)合成抑制劑CHM，研究抑制劑對Tl脅迫下草酸分泌的影響，以及Tl吸收能力與根系內(nèi)部草酸含量的關(guān)系。本研究將有助于更好地了解水稻在Tl脅迫下的吸收和耐受機制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)方法

選用常規(guī)水稻品種‘華粳秈’作為試驗材料，由華南農(nóng)業(yè)大學張桂權(quán)教授提供。采用水培方式，將水稻種子在26 ℃黑暗萌發(fā)。5 d后，將發(fā)芽種子移入1.1 L的育苗盆中(放入一個水稻苗支架，4個孔，每孔1個苗)，育苗盆中為通氣營養(yǎng)液。根據(jù)Yoshida等[12]配方制備營養(yǎng)液：2.9 mmol·L-1NH4NO3，0.32 mmol·L-1NaH2PO4，1.0 mmol·L-1K2SO4，1.0 mmol·L-1CaCl2，1.7 mmol·L-1MgSO4·7H2O，9.1 μmol·L-1MnCl2·4H2O，0.52 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，18 μmol·L-1H3BO3，0.15 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.16 μmol·L-1CuSO4·5H2O，36 μmol·L-1FeCl3·6H2O。培養(yǎng)的前3 d使用營養(yǎng)液濃度減半并把pH調(diào)至6.0，之后每3 d更換一次全營養(yǎng)液。脅迫處理前，將15 d秧齡的幼苗培養(yǎng)液更換為含3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2、1.5 mmol·L-1MgSO4、pH 6.0的處理液后過夜[13]，之后進行處理。所有試驗均在RTOP-500D人工氣候培養(yǎng)箱(浙江托普云農(nóng)科技)中進行，培養(yǎng)條件：12 h光照/12 h黑暗，晝夜溫度25/22 ℃，光照強度350 μmol·m-2·s-1，相對濕度75%。

1.2 試驗設(shè)計

對經(jīng)3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2和1.5 mmol·L-1MgSO4溶液(pH6.0)中過夜預(yù)處理的水稻秧苗，進行Tl脅迫處理，包括去離子水處理(對照，-Tl)、10(Tl10)和 25 μmol·L-1Tl處理(Tl25)共3個處理。每個處理3次重復，每個重復使用30株15 d秧齡的幼苗。

為了檢驗PG和NIF兩種陰離子通道抑制劑和蛋白質(zhì)合成抑制劑CHM對根系分泌、根和葉中草酸含量，以及根和葉中Tl含量的影響，將15 d秧齡幼苗浸泡在3.0 mmol·L-1Ca(NO3)2和1.5 mmol·L-1MgSO4溶液(pH 6.0)，過夜后進行以下7個處理，均處理12 h：①25 μmol·L-1Tl(Tl);②25 μmol·L-1CHM(CHM);③25 μmol·L-1Tl + 25 μmol·L-1CHM(Tl+CHM);④25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1PG(Tl+PG)；⑤25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1NIF(Tl+NIF)；⑥25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1PG + 25 μmol·L-1CHM(Tl+PG+CHM)；⑦25 μmol·L-1Tl + 50 μmol·L-1NIF + 25 μmol·L-1CHM(Tl+NIF+CHM)。處理后將稻苗轉(zhuǎn)移到去離子水中培養(yǎng)6 h，然后冷凍干燥蒸發(fā)除去根分泌物中的水分。

1.3 根系草酸含量檢測

根系外泌有機酸收集方法：稻苗分別處理2和12 h后轉(zhuǎn)移到去離子水中靜置6 h，用凍干法濃縮去離子水中的根系分泌物，殘留物溶解在2 mL 0.01 mol·L-1K2HPO4緩沖液(pH 2.75)中，再由0.45 μm濾膜過濾后上機檢測。

根系內(nèi)有機酸收集：將根系在3 mL含0.25 mol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)和1 mmol·L-1巰基乙醇的提取緩沖液中冰浴研磨，4 ℃、2 000 r·min-1離心15 min，通過0.45 μm 濾膜過濾后，上機進行HPLC(Shimadzu Prominence LC-20A，Japan)檢測。

檢測的色譜條件：流動相由0.01 mol·L-1K2HPO4緩沖液(pH 2.75)和甲醇組成，以97∶3的比例配制，流速0.6 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣體積20 μL，檢測波長210 nm，檢測時間10 min。

1.4 植物中的Tl含量檢測

水稻幼苗在含鉈處理液中分別處理2或12 h后，移去水稻幼苗，收集處理溶液并通過0.45 μm膜濾器過濾，利用火焰原子吸收光譜儀(FAAS，Shimadzu)測定處理液中殘存的Tl含量，同時測定水稻根系和葉片中的Tl含量：用去離子水沖洗根部3次，然后用濾紙吸干根部表面水分。分別測定根和葉的鮮重。隨后將根和葉片在105 ℃烘箱中干燥至恒重，用稀鹽酸浸泡12 h。最后，取3 mL浸泡液過濾后通過火焰原子吸收光譜儀測定Tl含量。

測定細胞壁、根和葉細胞質(zhì)中Tl含量：取0.10 g新鮮的根或葉，加入3 mL含0.25 mol·L-1蔗糖、1 mmol·L-1巰基乙醇、50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH7.5)的提取液，冰浴研磨，4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，得到沉淀成分，將上清液15 000 r·min-1離心30 min獲得上清液組分[14]。將沉淀用3 mL稀鹽酸浸泡12 h，過濾并通過FAAS測定細胞壁中的Tl含量。過濾最終的上清液并測定，記為細胞質(zhì)中的Tl含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并通過Duncan檢驗比較各組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tl脅迫下水稻植株的草酸分泌和Tl分布特征

目前，草酸是水稻在Tl脅迫下根系向外分泌的唯一一種有機酸。由圖1可知，對照組(-Tl)2和12 h的水稻根系向外分泌草酸量極低；2 h后Tl10處理的根際草酸含量為2.00 mg·g-1FW，Tl25處理的分泌量上升至4.47 mg·g-1FW；但12 h后兩個處理的根際草酸含量均下降，Tl10處理的根際草酸含量下降至0.66 mg·g-1FW，Tl25處理的根際草酸含量降至2.50 mg·g-1FW。-Tl處理的根系草酸含量在2 h后為16.15 mg·g-1FW，與Tl25處理2 h的值(18.65 mg·g-1FW)無顯著差異；2 h時Tl10處理的根系草酸含量顯著高于-Tl處理。12 h后，各處理間根系內(nèi)草酸含量沒有顯著差異。結(jié)果表明，Tl脅迫濃度升高會導致水稻根系外泌的草酸含量升高，但隨著Tl處理時間的延長，水稻根系外泌草酸含量反而下降。Tl脅迫主要影響根系向外分泌的草酸量，對根系內(nèi)部草酸含量影響不顯著。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異具有顯著性。

為研究重金屬Tl在水稻體內(nèi)的吸收與分布特征，測定了水稻不同部位的Tl含量，結(jié)果(表1)表明，Tl10處理12 h，整株水稻的Tl含量為0.018 mg·g-1FW，Tl25處理為0.035 mg·g-1FW，顯著高于Tl10處理。在Tl10和 Tl25處理下，根中的Tl含量約為整株水稻中總Tl含量的73.8%和77.2%，而葉中Tl含量僅為整株含量的26.1%和23.8%，兩個處理間均沒有差異。此外，Tl10和 Tl25處理的根細胞質(zhì)的Tl含量分別約為水稻植株總Tl含量的56.3%和59.6%，高于根細胞壁和葉細胞質(zhì)中的Tl含量。因此，Tl在水稻中的主要積累部位為根系，特別是根細胞質(zhì)中。

表1 Tl處理后水稻中Tl的吸收和分布

2.2 抑制劑對水稻草酸含量及Tl含量的影響

為了研究Tl脅迫下草酸分泌的模式，將陰離子通道抑制劑PG和NIF,及蛋白質(zhì)合成抑制劑CHM分別加入到Tl處理中，12 h后，測定根際、根內(nèi)和葉內(nèi)的草酸含量。由圖2可知，Tl處理的根際草酸含量為2.5 mg·g-1FW，而Tl處理分別添加3種抑制劑后，草酸分泌量發(fā)生了變化。NIF效果最為顯著，完全抑制了草酸的分泌；PG也具有較好的抑制效果，草酸分泌量降低至0.18 mg·g-1FW；CHM處理的根際草酸含量降至1.955 mg·g-1FW，但與Tl處理無顯著差異。對于根系內(nèi)草酸含量，Tl處理的根內(nèi)草酸含量為15.44 mg·g-1FW，添加CHM和NIF后根內(nèi)草酸含量顯著降低至12.32 和6.05 mg·g-1FW，而PG處理的抑制效果不明顯。對于葉內(nèi)草酸含量，這3種抑制劑添加均未對其產(chǎn)生顯著影響。因此，陰離子通道抑制劑NIF和PG在Tl脅迫下對水稻根外泌的草酸含量起明顯抑制作用，而蛋白質(zhì)合成抑制劑CHM基本不影響根系內(nèi)和外分泌的草酸含量。3種抑制劑對根系內(nèi)的草酸含量影響較小，對葉片內(nèi)草酸含量沒有影響。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異具有顯著性。

Tl處理下，植株內(nèi)部的Tl元素總含量為0.034 mg·g-1FW，其中根的Tl含量最高，為0.35 mg·g-1FW。Tl處理下添加PG、NIF和CHM后，均顯著降低水稻植株對Tl的吸收量，處理后植株的Tl含量分別為0.031、0.014和 0.029 mg·g-1FW，NIF的抑制能力最強。3種添加劑對根Tl含量影響的規(guī)律與植株基本一致。Tl處理的葉片Tl含量為0.095 mg·g-1FW，添加NIF后顯著下降為0.038 mg·g-1FW，添加PG和CHM后的葉片Tl含量與對照無顯著差異。因此，抑制劑NIF對植株、根及葉的Tl含量均有顯著抑制作用。

2.3 根內(nèi)草酸含量與水稻Tl吸收能力的關(guān)系

對Tl脅迫下水稻植株根系內(nèi)草酸含量與植株Tl吸收量進行相關(guān)性分析，結(jié)果(圖3)表明，水稻根內(nèi)草酸含量與植株體內(nèi)Tl含量存在線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)達到0.923, 相關(guān)性達到極顯著水平(P<0.01)。

3 討論

3.1 陰離子通道影響Tl脅迫下水稻根系的草酸分泌

水稻秧苗Tl處理2 h后，根系分泌的草酸量隨著Tl脅迫強度的升高而增加，Tl處理時間延長至12 h時，草酸分泌量逐漸降低。此現(xiàn)象表明，Tl可以快速激活水稻草酸的分泌，激活能力與Tl脅迫濃度相關(guān)。當陰離子通道抑制劑NIF加入到Tl脅迫的水稻處理液中，根系外分泌和根系內(nèi)部的草酸含量被顯著抑制；而蛋白質(zhì)合成抑制劑CHM添加不會顯著影響根的草酸分泌與含量。這表明，陰離子通道對Tl脅迫下草酸的分泌有重要影響。雖然PG和NIF均可抑制草酸的分泌，但NIF的抑制能力明顯強于PG，NIF不僅可以抑制水稻根系向外分泌草酸，還可以降低根系內(nèi)部的草酸含量。推測可能是NIF抑制了水稻根中草酸分泌通道蛋白的活化。但調(diào)節(jié)草酸分泌的草酸轉(zhuǎn)運蛋白與重金屬脅迫下草酸的分泌是否有關(guān)，還有待進一步證實[15]。

研究者普遍認為，重金屬脅迫下植物根尖有機酸分泌有兩種模式。模式Ⅰ植物中重金屬直接激活細胞壁表面的陰離子通道，從而分泌有機酸以螯合重金屬，此過程不涉及到新蛋白質(zhì)的合成與DNA的表達，對重金屬脅迫反應(yīng)迅速[16]。模式Ⅱ植物在受到重金屬脅迫時，有機酸的分泌需要依靠離子通道蛋白的合成，激活有機酸的分泌需要一定的時間，如決明根系分泌檸檬酸需要一定的反應(yīng)時間，也會被蛋白抑制劑CHM所抑制[6]?；诒狙芯恐兴驹赥l脅迫下的草酸分泌特征，初步認為水稻根中的草酸分泌模式屬于模式Ⅰ。

本研究發(fā)現(xiàn)，Tl脅迫下根系外分泌的草酸含量變化與根內(nèi)草酸含量變化沒有密切關(guān)系。Ma等[17]也曾報道過類似結(jié)果，在Al脅迫下有機酸陰離子的向外分泌不受根系內(nèi)部有機酸水平或根細胞合成有機酸能力的調(diào)節(jié)。這表明某些重金屬脅迫下植物根系有機酸分泌機制可能存在相似性。

3.2 Tl脅迫下水稻的內(nèi)部耐受機制

有機酸在植物對重金屬外部和內(nèi)部解毒中起重要作用。內(nèi)部解毒是指細胞質(zhì)中螯合重金屬的有機酸、液泡的區(qū)室化、或細胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)與重金屬結(jié)合，從而降低重金屬對植物的毒性等[18-19]。蕎麥中的草酸與Al形成穩(wěn)定的螯合物，有效降低了游離Al3+離子對植物細胞的毒性，提高了蕎麥對鋁的耐受性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻根系內(nèi)草酸含量與水稻全株Tl含量的相關(guān)系數(shù)為0.923，根系內(nèi)草酸含量與植物體內(nèi)Tl吸收量呈極顯著正相關(guān)。推測Tl與草酸能夠形成穩(wěn)定物質(zhì)以降低水稻細胞內(nèi)游離Tl+含量，從而提高對Tl的耐受。水稻應(yīng)對Tl脅迫的解毒機制可能與蕎麥體內(nèi)草酸解除Al毒機制有相似性，但還需要進一步驗證。

本研究首次提出Tl脅迫下促進水稻根系草酸分泌的模式屬于模式Ⅰ；明確了陰離子通道抑制劑NIF對Tl脅迫水稻根系草酸分泌的顯著抑制作用；水稻根系內(nèi)部草酸含量與Tl吸收量正相關(guān)，揭示了草酸對水稻植株內(nèi)部耐受Tl的貢獻，為進一步揭示Tl脅迫下水稻細胞及分子層面的耐受機制奠定基礎(chǔ)。