朱成磊 楊克彬 高志民

(國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所 國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實驗室 北京 100102)

水通道蛋白(AQPs) 是一類膜蛋白，對調(diào)節(jié)水和小分子溶質(zhì)通過生物膜至關(guān)重要。盡管第一個植物AQP在1987年從大豆(Glycine max) 中分離得到[1]，但第一個被證實具有功能的植物AQPs是1993年在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發(fā)現(xiàn)的γ 液泡膜內(nèi)在水通道蛋白(AtTIP1)[2]，之后又在多種植物中分離出不同類型的AQPs，如擬南芥、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高粱 (Sorghum bicolor) 和柳枝稷 (Panicum virgatum) 等植物分別有35、39、36、68和38個AQPs[3]?；谙到y(tǒng)發(fā)育分析和亞細(xì)胞定位，將維管植物AQPs分為5個亞家族，每個亞家族又可分為多個亞組。根據(jù)10個不同單子葉植物和雙子葉植物中共100個TIPs的進(jìn)化分析，TIPs分為5個不同的亞組 (TIP1、TI2、TIP3、TIP4和TIP5)[4]。TIPs定位于液泡膜上，TIPs調(diào)控液泡膜水分出入，實現(xiàn)細(xì)胞的迅速膨脹或緊縮，液泡膜對水具有極高的滲透性，其滲透率比質(zhì)膜高100倍[5]。除轉(zhuǎn)運(yùn)水分外，TIPs還兼有運(yùn)輸甘油[6]、H2O2[7]、NH3[8]、尿素[9]和硼[10]以及砷[11]吸收等方面的功能。因此，TIPs在響應(yīng)干旱、鹽等非生物脅迫[12]以及冷適應(yīng)能力[13]，維持植物正常生理活動方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用。

AQPs廣泛存在于植物中，有的在特定組織發(fā)揮作用，許多與生物脅迫和非生物脅迫密切相關(guān)，尤其是對干旱、鹽分以及富含重金屬的土壤的耐受性[14]?；蛟谥参锊煌M織中、同一組織的不同發(fā)育階段以及脅迫條件下的表達(dá)差異，反映了基因功能方面的差異。擬南芥、水稻和玉米不同發(fā)育時期TIPs基因的表達(dá)，以及在干旱和鹽脅迫條件下的表達(dá)變化均證明了這一點(diǎn)[15]。毛竹基因組草圖[16]發(fā)布后，人們開始了對毛竹AQPs的研究，發(fā)現(xiàn)TIP同源基因的5個亞組(TIP1、TIP2、TIP3、TIP4和TIP5) 在不同組織中表達(dá)存在一定的差異[17]，且干旱、水淹和NaCl處理均能引起部分毛竹TIPs基因表達(dá)的顯著變化[18]，但尚缺乏對毛竹TIPs基因的更全面分析。隨著染色體水平毛竹基因組的發(fā)布[19]，使人們能夠?qū)ζ渲蠺IPs成員的分子特征、系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行深入分析。低溫、干旱、光照等多種脅迫處理下的毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20-21]，便于對其中TIPs基因的表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)了解，預(yù)測其功能。在此基礎(chǔ)上，采用qPCR技術(shù)對不同脅迫條件下PeTIPs的表達(dá)進(jìn)行了驗證，以期為深入研究TIPs基因的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毛竹TIP基因查找

以水稻和擬南芥的TIP序列為誘餌，通過同源比對的方法在毛竹新版本基因組數(shù)據(jù)[19]中進(jìn)行比對分析，對所獲得的序列利用在線軟件HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，保留具有完整TIP保守結(jié)構(gòu)域的序列。最終獲得毛竹TIP基因成員，并根據(jù)它們與其他近緣物種的親緣關(guān)系進(jìn)行命名。

1.2 毛竹TIP基因生物信息學(xué)分析

利用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 網(wǎng)站對所獲得的毛竹TIP蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。運(yùn)用在線軟件MEME (http://meme.nbcr.-net/meme/intro.html) 對毛竹TIP蛋白的保守基序進(jìn)行分析，使用Plant-mPLoc網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/) 和TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 分別預(yù)測其亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)域。對毛竹TIP基因上游啟動子序列(2 000 bp) 中的調(diào)控元件，利用在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 進(jìn)行預(yù)測[22]。

利用TBtools[23]內(nèi)置的BLASTP程序?qū)γ窈退綯IP氨基酸序列進(jìn)行多向比對，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)定參數(shù)[24]，鑒定出具有共線性關(guān)系的基因，通過TBtools內(nèi)置的MCScanX程序[25]進(jìn)行做圖。另外，對所有TIP同源基因?qū)χg的同義(Ks) 和非同義(Ka) 核苷酸替換率進(jìn)行計算。利用MEGA 7.0內(nèi)置的Clustal W程序，對毛竹、擬南芥、水稻、高粱、玉米和二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等植物的TIP氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)置參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[26-27]。

1.3 非生物脅迫條件下毛竹RNA-seq數(shù)據(jù)中TIP基因的表達(dá)分析

根據(jù)文獻(xiàn)報道，從NCBI Short Read Archive(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) 下載低溫、干旱和強(qiáng)光脅迫處理毛竹的RNA-seq數(shù)據(jù)[20-21]，包括低溫或者干旱處理2 h和8 h后葉片及對照的RNA-seq數(shù)據(jù) (登錄號為SRS1759772)，強(qiáng)光[1 200 μmol/ (m2·s) ]處理0.5 h和8.0 h的毛竹幼苗葉片及對照的RNA-seq數(shù)據(jù)(登錄號為SRS942689)。根據(jù)基因注釋進(jìn)行比對查找，篩選其中TIP基因的FPKM (fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段值)，并對獲得FPKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，取以2為底的對數(shù) [Log2(FPKM+1)]的值作為基因的表達(dá)量，用TBtools軟件繪制表達(dá)譜熱圖，分析不同基因的表達(dá)情況。

1.4 不同脅迫條件下毛竹TIP基因的定量表達(dá)分析

在實驗室條件下(溫度25 ℃左右，光16 h/暗8 h，相對濕度80%左右) 培養(yǎng)毛竹實生幼苗，選擇2個月生長較一致的幼苗，隨機(jī)分成4組分別進(jìn)行處理。向A組基質(zhì)中添加250 mmol/L NaCl溶液至飽和狀態(tài)，B組基質(zhì)中添加20% PEG 6 000溶液至飽和狀態(tài)，C組放入4 ℃的光照培養(yǎng)箱中，D組置于1 200 μmol/ (m2·s) 的強(qiáng)光培養(yǎng)箱中。每個處理至少20株幼苗，每個處理均包含3次重復(fù)。分別在處理后0、1、2、4、8 h后分別收集A、B和C組根系樣品以及A、B、C和D組的葉片樣品，液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。選用試劑盒(Takara RNA) 提取樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存于-20 ℃冰箱用于后續(xù)試驗。

根據(jù)毛竹TIP序列設(shè)計特異的定量引物(表1)，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。10.0 μL的qPCR反應(yīng)體系:2 × SYBRⅡGreen I Master 5.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，正/反向引物0.3 μL，ddH2O 3.4 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，61 ℃退火10 s，循環(huán)42次。以PeNTB為內(nèi)參基因[28]，定量結(jié)果采用2-ΔΔCT法[29]分析，基于TBtools軟件取以2為底的對數(shù)[Log2(FPKM+1) ]進(jìn)行歸一化后繪制表達(dá)量圖。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primer sequences of qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹TIP基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

在毛竹新版本基因組數(shù)據(jù)中，共鑒定具有編碼完整TIP保守結(jié)構(gòu)域的基因19個，根據(jù)其他物種中TIP基因的命名規(guī)則，將它們分別命名為PeTIP1-1～ PeTIP1-3、PeTIP2-1～ PeTIP2-4、PeTIP3-1～ PeTIP3-2、PeTIP4-1～ PeTIP4-7和PeTIP5-1～PeTIP5-3(表2)。PeTIPs編碼蛋白氨基酸序列最短的為238 aa (PeTIP3-2)，最長為434 aa (PeTIP5-2)，分子量介于25.06～44.03 kDa之間；理論等電點(diǎn)介于5.54～9.88之間，除PeTIP3-2親水性較低之外，所有PeTIPs均為穩(wěn)定的親水性蛋白；大多數(shù)PeTIPs有6個跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示所有PeTIPs均定位于液泡膜上，其中PeTIP3-2還被定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。

表2 PeTIPs蛋白的理化性質(zhì)分析Tab.2 Putative basic physical and chemical characteristics analyses of PeTIPs

2.2 PeTIPs氨基酸的保守性分析

氨基酸保守基序分析表明，在PeTIPs序列中共鑒定獲得7個保守基序，其中基序1、2、3和6為共有基序；PeTIP3-2缺少基序4；PeTIP5-1和PeTIP5-3缺少基序 5；PeTIP2-2、PeTIP2-3、PeTIP4-6、PeTIP4-7和PeTIP5-3均缺少基序7 (圖1A)。每個保守基序中氨基酸序列的偏好性在PeTIPs不同成員間存在著一定的差異，但大多數(shù)是比較保守的，尤其是含有跨膜區(qū)(TM 1-TM 6) 和Loop-Half螺旋區(qū)(Loop B和Loop E) 的基序更為保守(圖1B)。同一個亞組大多數(shù)成員具有相同的保守基序，說明這些成員可能存在相似的功能。

圖1 PeTIPs氨基酸保守基序分析Fig.1 Analysis of conserved motifs in PeTIPs

AQPs運(yùn)輸?shù)孜锞哂羞x擇透過性，位于Loop B和Loop E處高度保守的NPA (Asn-Pro-Ala) 結(jié)構(gòu)域?qū)λ钟H疏性具有重要作用。對PeTIPs保守位點(diǎn)分析表明，所有序列均含有2個高度保守的NPA結(jié)構(gòu)域，除PeTIP3-2缺少TM 2的Ar/R選擇性過濾器之外，其余序列均含有Ar/R選擇性過濾器(TM 1-TM 6) 和Froger's殘基(表3)。在底物運(yùn)輸時，Ar/R選擇性過濾器是一種重要的選擇通過結(jié)構(gòu)，PeTIPs 5個亞組的Ar/R選擇性過濾器組合形式均不相同，其中PeTIP1s、PeTIP2s和PeTIP5s的分別為H-I-A-V、H-I-G-R和Q-V-A-R，而PeTIP3s和PeTIP4s的Ar/R選擇性過濾器則具有多種組合形式，分別為H-M/V-A-R和Q/H-T/I-A-R等形式。氨基酸Froger's殘基在底物運(yùn)輸過程同樣發(fā)揮著重要作用，PeTIPs的Froger's殘基保守性相對較高，主要為T/S-S-A-Y-W 2種形式。Ar/R選擇性過濾器的多態(tài)性和Froger's殘基的保守性預(yù)示著PeTIPs在毛竹生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的功能。

2.3 PeTIPs的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為深入了解PeTIPs的功能，通過對毛竹、水稻、擬南芥、玉米、高粱和二穗短柄草6個物種的71條TIP氨基酸序列進(jìn)行多重比對，基于MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，所有PeTIPs被聚類到5個分支(I-V)，且每個分支中的成員數(shù)量不等，其中I和V中均含有3個成員，II、III中分別含有4個和2個成員，IV中成員最多，為7個(圖2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，超過一半(11/19) 的PeTIPs成員被聚類在分支II和IV中，而水稻和擬南芥在這2個分支的成員分別只有5個和4個，且PeTIP4-2/PeTIP4-3、PeTIP4-4/PeTIP4-5和PeTIP4-6/PeTIP4-7均成對地聚類在1個分支上，這可能與毛竹進(jìn)化中經(jīng)歷了基因組復(fù)制事件有關(guān)[16]。另外，在分支V中毛竹有3個成員，而其他物種只含有1個成員，這可能是毛竹進(jìn)化中經(jīng)歷成員擴(kuò)張。另外，PeTIPs總是優(yōu)先與水稻或二穗短柄草TIP成員聚類在一起，說明PeTIPs與水稻等單子葉植物的同源蛋白的功能更相似。

表3 PeTIPs氨基酸保守位點(diǎn)分析Tab.3 The amino acid conserved site analysis of PeTIPs

圖2 基于不同植物TIP家族成員構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed on the base of TIP family members in different plant species

2.4 PeTIPs基因片段復(fù)制和共線性分析

基因復(fù)制在基因家族擴(kuò)張過程和功能演化中均發(fā)揮重要作用，而毛竹在進(jìn)化過程中也經(jīng)歷了基因組復(fù)制和基因家族擴(kuò)張事件[16]。相對于其他二倍體物種，毛竹TIP成員也出現(xiàn)了成員增多的現(xiàn)象(圖2)。對毛竹和水稻中TIP成員的共線性關(guān)系進(jìn)行分析結(jié)果表明，共有15個PeTIPs檢測到共線性關(guān)系，其中在PeTIPs間存在10對片段重復(fù)；另外，12個PeTIPs與水稻8個TIP基因存在18對片段重復(fù)，沒有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)以及其他重復(fù)類型的基因(圖3A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這28對重復(fù)片段中有11對發(fā)生在PeTIP4s分支中，另外還有9對重復(fù)片段發(fā)生在PeTIP5s分支中，這些結(jié)果支持了這2個分支發(fā)生過家族擴(kuò)張的推測。此外，非同義對同義取代比(Ka/Ks) 是判斷基因功能分化的重要指標(biāo)，對所有具有片段重復(fù)的基因進(jìn)行Ka/Ks分析結(jié)果顯示，28對TIP基因的Ka/Ks均小于1.0 (圖3B)。由此表明，PeTIPs在發(fā)生片段復(fù)制后，經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇，功能分化差異不大。

2.5 PeTIPs啟動子序列調(diào)控元件分析

圖3 毛竹和水稻TIP基因共線性和Ka/Ks 分析Fig.3 Collinearity and Ka/Ks analyses of TIP genes in moso bamboo and rice

圖4 PeTIPs基因啟動子調(diào)控元件分析Fig.4 Analysis of regulatory elements in promoter sequences of PeTIPs

為更好地了解PeTIPs對不同逆境脅迫和植物激素的響應(yīng)，對基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp基因組區(qū)域內(nèi)的調(diào)控元件進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，有8類作用元件參與脅迫和防御相關(guān)反應(yīng)，7類作用元件與植物激素響應(yīng)相關(guān)(圖4A)。有15個基因的啟動子中包含防御相關(guān)元件(STRE)，14個基因中包含厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元素(ARE)；在這些啟動子序列中還發(fā)現(xiàn)其他與脅迫相關(guān)的調(diào)控元件，如低氧特異增強(qiáng)元件(GC-motif)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件(W box) 和MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(MBS) (圖4B)。響應(yīng)植物激素的作用元件一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，在17個和16個基因的啟動子中分別發(fā)現(xiàn)了脫落酸響應(yīng)元件(ABRE) 和茉莉酸甲酯(MeJA) 響應(yīng)元件(CGTCA motif)，在12個基因中鑒定出GA響應(yīng)元件(GARE-motif和TGA-element)，而生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core) 則較少富集于PeTIPs中(圖4B)。這些結(jié)果表明，PeTIPs可能參與調(diào)節(jié)多種逆境脅迫和植物激素的應(yīng)激反應(yīng)。

2.6 基于非生物脅迫毛竹RNA-seq分析PeTIPs的表達(dá)模式

根據(jù)PeTIPs啟動子中調(diào)控元件分析的結(jié)果，利用已發(fā)表的毛竹RNA-seq數(shù)據(jù)，對逆境脅迫條件下葉片中PeTIPs的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在低溫、干旱和強(qiáng)光處理的毛竹葉片中，能檢測到大部分PeTIP1s和PeTIP4s的基因的表達(dá)，PeTIP2s中僅有PeTIP2-3有表達(dá)，幾乎檢測不到PeTIP3s和PeTIP5s的表達(dá)(圖5)。與處理前相比(0 h) 相比，低溫脅迫2 h后5個PeTIPs (PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3) 表達(dá)上調(diào)，至8 h時各基因的表達(dá)量又有所下調(diào)(圖5A)；干旱脅迫下的PeTIP1-2和PeTIP4-2也表現(xiàn)出相似趨勢(圖5B)。在強(qiáng)光處理0.5 h后，PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢，且至8 h時依然保持較高的表達(dá)量 (圖5C)。由此表明，PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3可能在參與毛竹葉片響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。

圖5 不同非生物脅迫條件下毛竹葉片中PeTIPs的表達(dá)模式Fig.5 Expression profiles of PeTIPs in leaves of moso bamboo under different abiotic stresses

2.7 基于qPCR技術(shù)分析非生物脅迫下PeTIPs的表達(dá)模式

為進(jìn)一步證實PeTIPs的表達(dá)模式，根據(jù)非生物脅迫的RNA-seq分析結(jié)果，選取6個(PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP1-3、PeTIP4-1、PeTIP4-2和PeTIP4-3) 在脅迫條件下葉片中表達(dá)變化的基因，采用qPCR技術(shù)進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明，隨著脅迫時間的延長，葉片中6個PeTIPs的表達(dá)呈現(xiàn)出一定的差異。在低溫、干旱、高鹽和強(qiáng)光脅迫處理下分別有2個(PeTIP4-1和PeTIP4-3)、3個(PeTIP1-3、PeTIP4-1和PeTIP4-3)、2個(PeTIP1-2和PeTIP4-2) 和1個(PeTIP4-3) 基因表現(xiàn)為不同程度的持續(xù)上調(diào)表達(dá)，且在脅迫處理中后期(4 h或8 h) 的表達(dá)量均顯著高于對照組(0 h)；在高鹽脅迫下的2個基因(PeTIP1-1和PeTIP1-3) 則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在脅迫處理4 h時表達(dá)量達(dá)到最高；此外，PeTIP4-2在干旱和高鹽脅迫下表達(dá)量均顯著高于對照組(0 h)，但表達(dá)呈波動變化(圖6A)。

圖6 不同脅迫條件下PeTIPs的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of PeTIPs under different stresses

另外，根據(jù)PeTIPs在脅迫條件下葉片中的qPCR結(jié)果，同時結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)中PeTIPs的組織表達(dá)情況[17]，選取8個在根中表達(dá)的PeTIPs(PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP1-3、PeTIP2-1、PeTIP2-2、PeTIP2-3、PeTIP2-4和PeTIP4-3)，分析它們在低溫、干旱和高鹽處理后毛竹幼苗根中的表達(dá)變化。結(jié)果表明，低溫處理下，除PeTIP2-2之外，其余7個PeTIPs在處理前期(1 h或2 h) 的表達(dá)量均較低，在處理中后期(4 h或8 h) 的表達(dá)量顯著上升。干旱脅迫下的8個基因變化趨勢各異，其中PeTIP1-3的表達(dá)量隨干旱處理時間延長而增加，而PeTIP2-1表現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢；PeTIP2-2在干旱處理2 h和4 h表達(dá)量較高，而PeTIP2-3則在處理1 h和8 h的表達(dá)量較高。在高鹽處理條件下6個基因(PeTIP1-1、PeTIP1-2、PeTIP2-1、PeTIP2-2、PeTIP2-3和PeTIP2-4) 的表達(dá)量均顯著高于對照組，2個基因(PeTIP1-3和PeTIP4-3)在處理前期(1 h或2 h) 的表達(dá)量均較低，在處理中后期(4 h或8 h) 的表達(dá)量上升，與對照組(0 h) 達(dá)到差異顯著水平(圖6B)。

3 討論

與動物相比，植物具有更多的AQPs亞家族和多樣的異構(gòu)體，其中有些是植物所特有的。研究表明，毛竹在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件和多數(shù)基因簇的分化[16]，PeTIPs存在成員增多的現(xiàn)象。與其他植物相似，PeTIPs亞家族的19個成員被分為5個亞組(圖2)[4，30-31]，且所有亞組成員均含有保守的NPA基序和Froger's殘基以及差異的Ar/R選擇性過濾器 (圖1和表3)。NPA基序是運(yùn)輸活動中必不可少的組成部分，在動物、植物、原生動物、真菌、真細(xì)菌和古細(xì)菌等多種MIPs中都比較保守[32-33]，而Ar/R選擇性過濾器則具有多樣性[34]，在決定底物親和性和通過生物膜的效率方面均發(fā)揮著重要作用[35]。如菠蘿Ar/R選擇性過濾器的Loop E上一個纈氨酸(V) 被丙氨酸(A) 替換后，水分運(yùn)輸效率降低，但可以兼容運(yùn)輸甲酰胺、尿素和甘油[14，33]。PeTIPs不同亞組間的Ar/R選擇性過濾器的多樣性預(yù)示著它們蛋白結(jié)構(gòu)和功能多樣性。另外，PeTIPs亞家族Froger's位點(diǎn)保守的T-S-A-Y-W殘基，推測它們可能也參與尿素和H2O2的運(yùn)輸[36]。

在進(jìn)化過程中，多倍體化是植物適應(yīng)新環(huán)境和形成新物種的重要機(jī)制[37]。TIPs是定位在液泡膜上的運(yùn)輸水分效率極高的一類膜蛋白，它主要負(fù)責(zé)水和小分子物質(zhì)的運(yùn)輸，并參與細(xì)胞膨壓調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞降解等過程[38]。TIPs還可以通過提高水分運(yùn)輸效率從而增強(qiáng)植物對干旱和鹽脅迫的耐受能力[39]。通過對毛竹種內(nèi)以及毛竹和水稻種間的TIPs的共線性分析發(fā)現(xiàn)，片段重復(fù)可能是PeTIPs數(shù)量增加的主要原因，且擴(kuò)張的基因主要集中在PeTIP4s和PeTIP5s亞組(圖3)。然而，28對基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1，表明PeTIPs在擴(kuò)張進(jìn)化的過程中受到了純化選擇，復(fù)制產(chǎn)生的新基因可能還沒有形成新的功能[40-41]。影響植物基因功能的因素有很多，其中轉(zhuǎn)錄因子通過識別靶基因啟動子特定位點(diǎn)調(diào)控基因表達(dá)是重要機(jī)制之一[42]。在PeTIPs啟動子序列中存在多種逆境和激素相關(guān)的調(diào)控元件(圖4)，其中已證明MYB轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合MBS參與干旱調(diào)節(jié)[43]，元件 AuxRR-core參與生長素響應(yīng)[44]，推測PeTIPs啟動子中所含相同的調(diào)控元件可能具有類似作用。

基因的表達(dá)特征是基因功能的重要表現(xiàn)方式。RNA-seq結(jié)果表明，不同PeTIPs亞組在脅迫條件下的葉片中的表達(dá)模式不同，暗示著其功能的差異，其中PeTIP1s和PeTIP4s的5個基因明顯參與葉片對逆境脅迫的響應(yīng)(圖5)。qPCR結(jié)果進(jìn)一步證明PeTIPs在不同逆境脅迫下表達(dá)模式存在差異，同一基因在毛竹不同組織中的表達(dá)模式也不盡相同(圖6)。另外，RNA-seq和qPCR結(jié)果也存在一定差異，原因可能是二者所用材料不一致。由此表明，PeTIPs在逆境條件下功能的多樣性，而其發(fā)揮作用的機(jī)制仍需更深入研究。目前，對植物AQPs的研究大多局限于其基因組和轉(zhuǎn)錄組以及單個基因功能的鑒定，很少涉及個體表型與特定AQP異構(gòu)體基因型的關(guān)聯(lián)研究[14]，這將是未來研究的重要方向。植物AQPs除了在提高水的利用率和耐旱、鹽、有毒土壤等方面具有廣泛的推廣應(yīng)用前景外，在土壤和水資源的生物修復(fù)方面也有很大的潛力。此外，含有植物AQP的膜可用于各種溶質(zhì)或氣體 (CO2、NH3) 的凈化，將在食品加工、改進(jìn)和恢復(fù)工業(yè)正常環(huán)境中發(fā)揮重要作用[14]。因此，要發(fā)揮PeTIPs在生產(chǎn)生活等方面的功能，仍需開展大量的基礎(chǔ)性研究工作。

4 結(jié)論

在毛竹新版本基因組中共鑒定出19個PeTIPs基因，分為5個亞組，各亞組成員均具有完整的保守結(jié)構(gòu)域。PeTIPs啟動子區(qū)域中含有多種參與脅迫、激素響應(yīng)的調(diào)控元件，RNA-seq數(shù)據(jù)和qPCR結(jié)果證實了PeTIPs參與低溫、干旱和強(qiáng)光的脅迫應(yīng)答，推測它們在毛竹抵御外界逆境脅迫時發(fā)揮著不同的功能。研究結(jié)果將為進(jìn)一步開展毛竹基因工程研究提供候選基因資源，對培育毛竹抗逆新品種具有重要參考價值。