葉 坪，何宣婷,何 嵋，彭 瀟，張文艷，師 睿

（昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000）

1 引言

魔芋屬于被子植物門、單子葉植物綱、天南星科、魔芋屬，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值和保健價(jià)值都非常高的多年生草本植物，又名蛇六谷、雷星、鬼芋、蛇頭草、蛇包谷[1]等。我國(guó)是魔芋種植大國(guó)，種植總面積多達(dá)十萬(wàn)多公頃，魔芋資源主要分布在云南、貴州、四川、陜南和湖北等地的山區(qū)。魔芋產(chǎn)業(yè)是這些地區(qū)的重要支柱產(chǎn)業(yè)[2]。在昭通市11 縣區(qū)大面種植的主要有白魔芋（Albus）和花魔芋（Akoac）兩種。魔芋產(chǎn)業(yè)有巨大的發(fā)展前景，在藥理價(jià)值方面，魔芋是我國(guó)的一種古典醫(yī)藥[3]，除具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、減肥作用外，還具有胃腸道保護(hù)功能、通便、止血等作用[4]。在食用價(jià)值方面，可以制作成魔芋豆腐、魔芋餅干、魔芋粉條、魔芋糕等味道鮮美，口感宜人的食品，也可作為添加劑應(yīng)用于各類保健食品、美容食品和兒童營(yíng)養(yǎng)食品之中[5]。在生態(tài)價(jià)值方面，魔芋的規(guī)模化種植，能提高植被覆蓋度、減少水土流失、保護(hù)生態(tài)環(huán)境[6]。

魔芋塊莖中主要含葡甘聚糖（簡(jiǎn)稱KGM）、蛋白質(zhì)及多種氨基酸、淀粉、生物堿、神經(jīng)酰胺、微量元素、維生素等成分[7]。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是人體中不可缺少的組成成分[8]。蛋白質(zhì)與人體的營(yíng)養(yǎng)代謝、氧氣運(yùn)輸、信息交流、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)免疫和遺傳物質(zhì)等相關(guān)[9]，具有構(gòu)成機(jī)體、修復(fù)組織、構(gòu)成酶和激素等活性物質(zhì)、供給機(jī)體能量等生理功能，也是人體中氮的唯一來(lái)源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[10]。

考馬斯亮藍(lán)法是目前實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)、靈敏度最高的一種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法[11]?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)具有成本低、快速簡(jiǎn)捷、精密度高、顯色靈敏、重現(xiàn)性好及干擾物質(zhì)少[12]等優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)的蛋白質(zhì)數(shù)量低達(dá)1 ug[13]，是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法，可作為微量蛋白質(zhì)測(cè)定的首選方法[14]。蛋白質(zhì)是一項(xiàng)質(zhì)量和資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，用一種快速、準(zhǔn)確、方便的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量是必不可少的[15]。魔芋化學(xué)成分種類很多且含量豐富，但目前研究最多的是葡甘聚糖，對(duì)其他成分研究應(yīng)用較少且造成資源浪費(fèi)，現(xiàn)對(duì)昭通市彝良、鎮(zhèn)雄、巧家、永善四縣區(qū)花魔芋和白魔芋中水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行提取及含量的測(cè)定，旨在為今后昭通地區(qū)的魔芋開(kāi)發(fā)利用提供部分理論數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù)[16]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

將采自彝良、鎮(zhèn)雄、巧家、永善四縣的新鮮白魔芋和花魔芋洗凈切成小片，放入40 ℃恒溫干燥箱烘20 小時(shí)，用粉碎機(jī)粉碎過(guò)60 目篩后，制得魔芋粉，裝入樣品瓶中備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

2.3 實(shí)驗(yàn)藥品

表2 實(shí)驗(yàn)藥品

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 溶液的配制

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取牛血清白蛋白10.10 mg于100 mL 燒杯中，加入蒸餾水溶解，移入100 mL容量瓶，加蒸餾水定容[17]。得0.1010 mg/mL 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入4 ℃冰箱中保存。

考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液：稱取100.5 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250 于500 mL 燒杯中，依次加入95%乙醇50 mL，85%磷酸100 mL，溶解后移入1 L 容量瓶中，最后用蒸餾水定容[18]，得0.1005 mg/mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液（棕紅色），過(guò)濾后置于棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

用吸量管吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 于10 mL容量瓶中，然后加入考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液5 mL，最后加蒸餾水定容，搖勻后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540～640 nm 下測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)，每隔20 nm 測(cè)定一次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 最大吸收波長(zhǎng)結(jié)果

圖1 表明在波長(zhǎng)580～600 nm 有最大吸收波長(zhǎng)，然后在580～600 nm 之間每隔2 nm 測(cè)定一次，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 最大吸收波長(zhǎng)結(jié)果

圖2 表明，在波長(zhǎng)588 nm 時(shí)，測(cè)定的吸光度值最大，達(dá)到0.499，因此選擇588 nm 為最大吸收波長(zhǎng)。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用7 個(gè)10 mL的容量瓶做好標(biāo)記，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液，加蒸餾水定容，搖勻靜置10 min。用722 型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)588 nm 下以0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液容量瓶為空白對(duì)照比色，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：Y=0.0557X+0.0829，牛血清蛋白含量（X）和吸光度（Y）的相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，表明方程的線性良好可應(yīng)用。

2.4.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

將提取液用4000 r/min 的離心沉淀器離心15 min，用吸量管吸取0.2 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液5 mL，加蒸餾水定容，室溫條件下反應(yīng)10 min，在588 nm 處測(cè)定吸光度，平行做3 個(gè)重復(fù)，取其吸光度的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出提取液濃度，代入下列公式計(jì)算魔芋中蛋白質(zhì)的含量。

2.4.5 單因素試驗(yàn)

以提取溫度、提取時(shí)間和提取料液比三個(gè)因素作為對(duì)象來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定魔芋中水溶性蛋白質(zhì)的最佳提取條件。依據(jù)查閱的參考文獻(xiàn)，綜合考慮基礎(chǔ)條件設(shè)定為：提取料液：1∶35（g/mL）、提取時(shí)間50 min，提取溫度40 ℃。

2.4.5.1 最佳提取溫度的確定

用電子分析天平分別稱取8 份永善縣白魔芋粉1 g 置于燒杯中，按1∶35（g/mL）料液比加入蒸餾水，攪拌均勻后放入恒溫水浴鍋中，溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，浸提50 min，按上述1.4.4 測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4.5.2 最佳提取時(shí)間的確定

用電子分析天平分別稱取8 份永善白魔芋粉各1 g，置于燒杯中，按1∶35（g/mL）料液比加入蒸餾水，攪拌均勻后放入40 ℃恒溫水浴鍋中分別浸提20、30、40、50、60、70、80、90 min，按上述1.4.4 測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4.5.3 最佳提取料液比的確定

用電子分析天平分別稱取6 份永善白魔芋粉各1 g，置于燒杯中，分別按料液比（g/mL）為1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、加入蒸餾水，攪拌均勻后放入35 ℃恒溫水浴鍋中分別浸提60 min，按上述1.4.4 測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4.6 樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

用電子分析天平分別稱取彝良、鎮(zhèn)雄、巧家、永善四縣的白魔芋粉和花魔芋粉各1 g 于燒杯中，按上述最佳提取條件浸提，得到蛋白質(zhì)提取液，按上述1.4.4 測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 最佳提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按2.4.5.1 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度，計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 最佳提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4 可知，蛋白質(zhì)含量隨著提取溫度的升高，呈先增加后降低的趨勢(shì)，溫度在25 ℃～35 ℃之間，測(cè)得的蛋白質(zhì)含量隨溫度升高而增加，是因?yàn)榉肿拥臄U(kuò)散速率隨溫度的升高而增加，有利于蛋白質(zhì)分子的溶解[19]。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，測(cè)得的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到2.00%，而后隨著溫度的升高，測(cè)得的蛋白質(zhì)含量開(kāi)始降低，這是由于溫度逐漸升高，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)開(kāi)始發(fā)生變化，水溶性蛋白質(zhì)含量逐漸降低。因此，提取溫度選擇35 ℃為宜。

3.1.2 最佳提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按2.4.5.2 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度，計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 最佳提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5 可知，在20～40 min 之間，測(cè)得的蛋白質(zhì)含量隨提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。在40～60 min 之間，隨提取時(shí)間的增加而呈快速上升的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為60 min 時(shí)，測(cè)得的蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值，達(dá)到1.98%。60 min 后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)測(cè)得的含量逐漸降低。為了縮短工時(shí)減少能耗，提取時(shí)間選擇60 min 為宜。

3.1.3 最佳提取料液比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按2.4.5.3 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度，計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 最佳提取料液比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6可知，提取料液比在1∶25～1∶35（g/mL）之間，隨著提取液增加，測(cè)得水溶性蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)。當(dāng)提取料液比達(dá)到1∶35（g/mL）時(shí)，測(cè)得蛋白質(zhì)的含量最高，達(dá)到1.91%。提取料液比在1∶35～1∶50（g/mL）之間，測(cè)得蛋白質(zhì)的含量開(kāi)始降低，但變化趨勢(shì)較為緩慢，這是由于一定體積的提取液已將有效成分基本溶出[20]，提取料液比選擇1∶35（g/mL）為宜。

3.2 樣品的測(cè)定結(jié)果

按2.4.4 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行4 縣區(qū)花魔芋和白魔芋的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，各縣的花魔芋和白魔芋均平行做3 個(gè)重復(fù)，計(jì)算其平均含量，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 魔芋水溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

由圖7 可知，在不同地區(qū)同一品種魔芋中所含的水溶性蛋白質(zhì)含量有差異，同一地區(qū)花魔芋和白魔芋中的水溶性蛋白質(zhì)含量也有差異，但差異不大。

測(cè)得四個(gè)縣區(qū)白魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是永善縣，達(dá)到2.14%。含量的高低順序是：永善縣（2.14%）＞巧家縣（2.07%）＞彝良縣（1.89%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.87%）

四個(gè)縣區(qū)花魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是鎮(zhèn)雄縣，達(dá)到2.12%。含量的高低順序是：鎮(zhèn)雄縣（2.12%）＞彝良縣（1.98%）＞巧家縣（1.93%）＞永善縣（1.83%）。

3.3 測(cè)定方法的檢驗(yàn)

3.3.1 精密性實(shí)驗(yàn)

用吸量管分別吸取6 份蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL于10 mL 容量瓶中，然后按上述2.4.4 測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD 值，如表3所示，得RSD =1.54%＜5%，表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度較好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取永善縣白魔芋粉1 g，按上述最佳提取條件浸提得到蛋白質(zhì)提取液，然后按上述2.4.4 測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，每隔10 min 進(jìn)行1 次測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄其吸光值變化，觀測(cè)其穩(wěn)定性。如表4所示可知，在顯色1 小時(shí)內(nèi)吸光度值比較穩(wěn)定，RSD=0.11%＜5%，表明1 小時(shí)內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性較好[21]。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別稱取6 份永善縣白魔芋粉各1 g，按上述最佳提取條件浸提得到蛋白質(zhì)提取液，然后按上述2.4.4 測(cè)定方法分別進(jìn)行測(cè)定，記錄其吸光度值，計(jì)算RSD 值。如表5所示，得RSD=1.64%＜5%，表明該方法重復(fù)性較好。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.4 回收率試驗(yàn)

取6 份已知含量的白魔芋粉各1 g，按照上述最佳提取條件浸提，得到蛋白質(zhì)提取液。用吸量管吸取0.1 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，然后按上述2.4.4 測(cè)定方法分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD 值，如表6所示，得RSD=2.25%＜5%，表明該方法準(zhǔn)確度較高[22]。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論與分析

4.1 本論文采用水浸提法對(duì)昭通4 個(gè)縣區(qū)魔芋中水溶性蛋白進(jìn)行提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了魔芋中水溶性蛋白質(zhì)的最佳提取條件為：提取溫度35 ℃，提取時(shí)間60 min，提取料液比1∶35（g/mL）。

4.2 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定魔芋中水溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明不同產(chǎn)地魔芋中水溶性蛋白質(zhì)含量有所差別，同一地區(qū)花魔芋和白魔芋中的水溶性蛋白質(zhì)含量也有差異，但差異不大。

4.3 測(cè)得四個(gè)縣區(qū)白魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是永善縣，達(dá)到2.14%。含量的高低順序是：永善縣（2.14%）＞巧家縣（2.07%）＞彝良縣（1.89%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.87%）

4.4 四個(gè)縣區(qū)花魔芋中水溶性蛋白含量最高的縣是鎮(zhèn)雄縣，達(dá)到2.12%。含量的高低順序是：鎮(zhèn)雄縣（2.12%）＞彝良縣（1.98%）＞巧家縣（1.93%）＞永善縣（1.83%）。

4.5 本試驗(yàn)精密性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率良好，測(cè)定方法相對(duì)準(zhǔn)確。