張云霄，任 婷，葉苗苗，王元元，陶 靜，李 言

肺微血管內皮細胞作為保護肺臟的第一道門戶，其屏障功能在其中發(fā)揮著至關重要的作用。在感染性疾病誘發(fā)的急性肺損傷(ALI)時，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起肺內微血管內皮細胞與中性粒細胞黏附增加以及巨噬細胞細胞炎癥因子的釋放，細胞骨架相關信號通路被激活，下游肌動蛋白細胞骨架重構，從而導致內皮細胞損傷繼而引發(fā)肺內微血管內皮屏障破壞。因此，通過LPS建立在體或離體炎癥模型[1-2]成為研究ALI的常用實驗方法。

Ras相關的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是小G蛋白家族成員之一，其活性形式Rac1-GTPase能夠對細胞骨架的調節(jié)產生重要影響。Rac1通過作用下游靶點cAMP依賴的蛋白激酶A(PAK)激活LIM激酶(LIMK)[3],LIMK通過磷酸化抑制絲切蛋白(cofilin)誘導的肌動蛋白解聚，間接促進肌動蛋白應力纖維形成、細胞骨架重構，繼而引發(fā)細胞通透性的改變[4]。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)的化學成分是四甲基吡嗪，主要來源于中國傳統(tǒng)中藥川芎的根莖提取物，可以通過抑制炎癥反應減輕機體膿毒癥癥狀[5]，臨床上廣泛應用于擴張血管、改善微循環(huán)等方面[6]。課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)TMP可以降低通路中相關蛋白的表達來減弱LPS對內皮細胞骨架的損傷[7]。但是TMP對于Rac1/LIMK1信號通路上游分子的調控機制并不確定。為此本實驗通過檢測TMP在人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)體外模型上引起的通透性的改變，以明確TMP對LPS誘導損傷血管內皮細胞后通透性升高的改善情況；Western blotting檢測Rac1/LIMK1信號通路相關蛋白表達情況；從分子水平探討Rac1/LIMK1信號通路是否參與LPS誘導的內皮細胞損傷，探討TMP干預Rac1/LIMK1信號通路的具體分子學機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 健康足月剖宮產新生兒臍帶，標本取自蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院產科(均征得產婦同意)；鹽酸TMP(中國食品藥品檢定研究院)；LPS(0111美國SIGMA公司)；ECM培養(yǎng)基(ScienCell公司)；胰酶、4%多聚甲醛(Biosharp公司)；基質膠(CORNING公司)；FITC標記葡聚糖(美國SIGMA公司)；Transwell培養(yǎng)板(CORNING公司)；Rac1活性檢測試劑盒、LIMK1、p-LIMK1抗體(Abcam公司)；β-actin(ABclonal公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVECs原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng) 無菌條件下，取約15 cm的新生兒臍帶，37 ℃預熱的PBS沖洗3次。注入預熱的0.25%胰酶消化液15～20 mL，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～6 min，充分消化臍靜脈內皮。收集消化液，用ECM完全培養(yǎng)基沖洗臍靜脈管腔，收集胰酶-ECM培養(yǎng)基混合液于離心管，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入3 mL完全培養(yǎng)液，用吹打管吹打均勻，按1×105個接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，達到70%～80%融合后，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化、傳代培養(yǎng)，經Ⅷ因子抗體免疫組織化學鑒定為血管內皮細胞后，將2～3代用于實驗。

1.2.2 內皮細胞鑒定 用ECM不完全培養(yǎng)基稀釋的基質膠(1∶8)包被六孔板內的無菌蓋玻片，PBS沖洗3次晾干待用；取2～3代對數(shù)生長期的HUVECs，0.25%胰酶消化并1 000 r/min離心5 min，ECM培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，以每孔3×105個細胞接種于蓋玻片上；37 ℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞融合80%以上程度時棄去舊培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，冷丙酮固定10 min；PBS沖洗2次，3%H2O2常溫孵育30 min;PBS沖洗2次，加入1∶100Ⅷ因子兔抗人抗體，4 ℃濕盒內孵育12 h；PBS沖洗2次，滴加山羊抗兔IgG，常溫孵育20 min；混合DAB試劑盒內A、B、C液各1滴于1 mL PBS緩沖液中，常溫染色20 min，PBS緩沖液清洗2次；蘇木精復染5 min；無水乙醇脫水2次，每次2 min；二甲苯透明2次，每次2 min；中性樹膠封片；顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 細胞分組 正常對照組(不做藥物及損傷處理)、LPS組(LPS 1 μg/mL作用12 h)、TMP低、中、高劑量防治組(TMP終濃度分別為60、120、240 μg/mL作用12 h后+LPS 1 μg/mL繼續(xù)作用12 h)、純TMP組(TMP 240 μg/mL作用24 h)。

1.2.4 HUVECs體外模型的構建及通透性檢測 Transwell上構建HUVECs單層模型：Transwell板由上、下室兩部分構成。上室底是由透明聚酯薄膜構成(孔徑0.4 μm)，下室是24孔培養(yǎng)板。細胞按5×103接種在Transwell上室濾膜，濾膜提前12 h鋪被ECM不完全培養(yǎng)基稀釋的基質膠(1∶8)包被處理，培養(yǎng)4～5 d待細胞完全融合為單層后進行藥物干預分組處理。在Transwell上室加入用ECM不完全培養(yǎng)基配制的異硫氰酸螢光素-右旋糖酐(FITC-Dextran)溶液(500 μg/mL)100 μL，在Transwell下室加入ECM不完全培養(yǎng)基600 μL，在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內孵育1 h后，從每個嵌套小室上層和下層分別取液100 μL，加入黑色96孔板中，用Synerge Ⅱ多功能酶標儀(BioTek公司，美國)測定Transwell小室上下雙層液體中的熒光強度值，激發(fā)光波長495 nm，發(fā)射光波長520 nm。內皮細胞單層對右旋糖苷通透性的大小用通透系數(shù)(Pa)表示，計算公式為：Pa=(下室熒光強度值)×(下室液體體積)/FITC孵育時間(s)/濾膜面積(cm2)/上室熒光強度值。實驗結果以Pa%表示，Pa%=(實驗樣品組Pa/實驗對照組Pa)×100%。

1.2.5 體外模型的跨內皮細胞電阻值(TEER)測定 將RE1600上皮細胞電壓電阻儀的兩片電極分別置于濾膜表面及濾膜下,12只Transwell上室加入ECM完全培養(yǎng)基200 μL,下室加入ECM完全培養(yǎng)液1 000 μL，用RE1600上皮細胞電壓電阻儀測量每個Transwell小室的基礎電阻值,Transwell上室接種細胞懸液后,分別在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h測量電阻值,TEER按以下公式計算：TEER(單位:Ω×cm2)=(內皮細胞電阻值-基礎電阻值)×Transwell上室濾膜的底面積(0.33 cm2),然后繪制TEER-時間曲線。當TEER達到標準值并穩(wěn)定后,上室內更換為相應實驗培養(yǎng)液,下室內更換為ECM完全培養(yǎng)基。置CO2培養(yǎng)箱。在加入干預因素后0、12和24 h測定各孔的TEER值,并繪制各組TEER值變化曲線。

1.2.6 各組細胞蛋白表達檢測實驗

1.2.6.1 細胞分組與蛋白收集 根據(jù)Rac1活性檢測試劑盒說明書，將2～3代HUVECs接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞融合90%以上作分組藥物干預(分組情況同通透性檢測實驗)，每個細胞培養(yǎng)瓶中加入1 mL 1× Assay Buffer-蛋白酶抑制劑混合液(1 000∶1)，冰上裂解20 min；收集混合液，1 000 r/min離心5 min；取上清液至新EP管中；BCA法定量各組上清液中蛋白含量，2 000 μg/mL。

1.2.6.2 Rac1-GTPase下拉實驗 取500 μL各組蛋白上清樣品，1×Assay Buffer調節(jié)體積至1 mL；取40 μLPAK1 PBD瓊脂糖珠漿液加入各組蛋白樣品中；4 ℃震蕩孵育1 h；19 ℃ 14 000 r/min離心10 s，沉淀瓊脂糖珠；吸出上清液轉移至新的EP管中；500 μL 1× Assay Buffer洗滌瓊脂糖珠3次，每次離心后小心吸出上清液，保留珠粒沉淀；將珠粒沉淀重懸于40 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2×)中，混勻后快速離心10 s，蛋白樣本于PCR儀中95 ℃ 5 min加熱變性。所得樣品直接Western blotting檢測。

1.2.6.3 Western blotting檢測各組細胞蛋白表達 制作SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入30 μg蛋白樣品，經Bio-Rad電泳儀進行電泳，轉膜，5%BSA封閉1～2 h，TBST稀釋一抗(Rac1 1∶1 000、LIMK1 1∶1 500、p-LIMK1 1∶1 500、β-actin 1∶10 000)4 ℃孵育過夜，TBST液洗膜20 min后二抗孵育1 h，再經TBST洗膜30 min；最后加入顯影液上機曝光檢測目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 正常HUVECs形態(tài)學觀察以及細胞鑒定結果 使用0.25%胰酶灌注成功將HUVECs消化下來，12 h后倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞處于貼壁狀態(tài)，亮空泡狀的無活性細胞較少(見圖1A)。原代培養(yǎng)4 d后觀察內皮細胞融合為單層，密度可高達90%以上，細胞形態(tài)呈飽滿的不規(guī)則鋪路石狀緊密排列(見圖1B)。鏡下觀察細胞質內大量黃褐色顆粒聚集于細胞核周圍(見圖1C)，Ⅷ因子相關抗原蛋白呈陽性表達，可證明培養(yǎng)的細胞為內皮細胞。

2.2 各組細胞通透性檢測結果 與正常對照組相比，LPS組Pa升高明顯(P<0.01)；與LPS組相比，3組TMP防治組Pa呈下降趨勢(P<0.05～P<0.01),并且具有一定的濃度依賴性(見表1)。

表1 各組間內皮細胞單層通透性比較

2.3 TEER測定結果 細胞接種Transwell小室12 h內，TEER值受細胞貼壁影響明顯升高，12～84 h這一階段細胞TEER值呈穩(wěn)定趨勢增長[12、24、36、48、60、72 h分別為4.59±0.53、5.69±0.10、6.58±0.51、7.63±0.60、9.01±0.19、(10.28±0.60)Ω×cm2]，84 h后細胞TEER值增長明顯減緩[84、96、108 h分別為12.55±0.19、13.54±1.26、(13.60±0.33)Ω×cm2](F=189.042,P<0.05,MS組內=0.301)。LPS作用12 h時，與正常對照組相比，LPS組TEER值顯著性降低(P<0.05)；與LPS組相比，TMP中、高劑量防治組TEER顯著升高(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

表2 LPS作用12 h前后各處理組TEER值變化情況比較

2.4 各處理組細胞蛋白樣品中目的蛋白表達情況 與正常對照組比較，LPS組Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白表達均明顯上調(P<0.01)；TMP高劑量防治組與LPS組比較，Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白表達均明顯下調(P<0.05～P<0.01)(見圖2、表3)。

表3 各組Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白相對表達量比較

3 討論

內皮細胞是血管表面與血液和組織之間形成的一道單層界面，是調節(jié)血管滲透的一道重要屏障[8]，肺微血管內皮細胞受損作為ALI發(fā)病的最初環(huán)節(jié)，可以繼發(fā)導致肺微血管內皮細胞屏障功能受損，從而引起肺泡毛細血管壁通透性增加。而這種內皮屏障功能對維持循環(huán)穩(wěn)定以及組織器官正常功能具有重要意義[9]。內皮細胞或是其他種類的真核細胞，其完整的細胞形態(tài)都離不開細胞骨架架構出的一道復雜且嚴謹?shù)牧Ⅲw網狀結構。當細胞受到LPS刺激時，細胞骨架相關信號通路被激活，導致細胞骨架相關蛋白表達發(fā)生變化，細胞骨架重構，最終導致內皮細胞通透性增高。

測定TEER以及熒光標記大分子物質通透性是檢測內皮細胞屏障系統(tǒng)的常用方法。使用這2種方法聯(lián)合檢測可以減少人為因素的干預以及細胞早期通透性變化信息的丟失[10]。我們選擇用基質膠提前包被內皮細胞的體外生長環(huán)境模擬細胞-基底膜的黏附連接，通過檢測內皮細胞時間-TEER值的變化判斷細胞的融合情況，對細胞間緊密連接完整性進行評估。在接種細胞84 h后TEER值增長速度明顯減慢進入“平臺期”，細胞發(fā)生接觸抑制。但是細胞TEER值進入“平臺期”的時間節(jié)點會隨著細胞接種數(shù)目的增多而相應的縮短。LPS作用之前，各組細胞TEER值沒有顯著性差異，加入LPS作用12 h后，與正常組相比，LPS組TEER值下降明顯。國內外相關研究[7，11]發(fā)現(xiàn)TMP在抗炎、內皮細胞保護等方面具有良好的效果，我們在內皮細胞體外模型中加入不同劑量的TMP(60、120、240 μg/mL)進行預保護處理，結果發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比，TMP中、高劑量防治組TEER值顯著升高。另外，在各組細胞對FITC-葡聚糖的通透系數(shù)百分比Pa檢測實驗結果中發(fā)現(xiàn)，LPS組Pa較正常組明顯增高；TMP低、中、高劑量防治組Pa較LPS組相比呈不同程度降低?？梢哉f明LPS對內皮細胞屏障造成較明顯破壞，而TMP在改善LPS對內皮細胞屏障的破壞上發(fā)揮了積極的作用。

Rac1是細胞骨架相關通路中重要的上游分子，作為小G蛋白家族成員之一，能夠與GTP/GDP結合，對下游信號通路產生on/off效應[12]。Rac1-GTPase還可以通過作用下游靶點PAK1激活LIMK。關于LIMK1對細胞骨架，涉及到的比較經典的兩個通路是Rac1/PAK/LIMK1/Cofilin信號通路以及RhoA/ROCK/LIMK1/cofilin信號通路。LIMK1是磷酸化cofilin的重要激酶，LIMK1的活性形式p-LIMK1可以將cofilin N端第三位絲氨酸磷酸化，p-cofilin為cofilin的失活態(tài)，從而cofilin誘導的肌動蛋白解聚減少，聚合態(tài)的肌動蛋白增加，引起細胞骨架重構[13]。WOO等[14]在LPS誘導的大鼠成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)LPS引起Rac1激活，并且呈時間依賴性。在我們的Western blotting實驗檢測中發(fā)現(xiàn)，LPS組較正常組Rac1-GTPase活性蛋白表達上調，并且TMP高劑量保護組中Rac1-GTPase活性蛋白表達較LPS組下降。對各組總蛋白的Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，LPS組較正常組p-LIMK1蛋白表達升高，TMP中、高劑量保護組較LPS組的p-LIMK1蛋白表達則出現(xiàn)下調，結合上述通透性實驗相關數(shù)據(jù)可以說明TMP對LPS誘導的內皮細胞屏障功能損傷的保護作用可能與其下調Rac1/LIMK1信號通路中Rac1-GTPase活性蛋白、LIMK1磷酸化蛋白表達有關。對于TMP是否參與其他骨架蛋白相關信號通路的調節(jié)有待進一步研究證實。