張佳麗，聶光偉，劉 軍，左 波

（農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北武漢 430070）

分子標(biāo)記輔助選擇（Marker Assistant Selection，MAS）是指在基因克隆或定位的基礎(chǔ)上，通過(guò)分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，在群體中對(duì)含有目標(biāo)性狀的個(gè)體進(jìn)行選擇[1-2]。對(duì)含有目標(biāo)性狀的個(gè)體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的選擇，而且不受外界環(huán)境的影響，這在一定程度上解決了育種過(guò)程中存在的盲目性、效率低的問(wèn)題，大大加快了育種進(jìn)程[3]，促進(jìn)了分子標(biāo)記輔助選擇和基因組選擇在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用。豬MAP2K6基因位于12 號(hào)染色體，編碼絲裂原活化蛋白激酶激酶6（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 6，MAP2K6）。MAP2K6基因?qū)儆贛APK家族的一員，目前已鑒定出4 種MAPK家族成員，分別是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（Extracellular Signal-regulated Kinase 1/2，ERK1/2）、ERK（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogenactivated Protein Kinase，p38MAPK）和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）[4]，分別介導(dǎo)4 條并行的MAPK信號(hào)通路。其家族成員主要參與調(diào)控多種細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能被生長(zhǎng)因子、促細(xì)胞分裂素、細(xì)胞因子及各種形式的環(huán)境應(yīng)激因素所激活，而MAP2K6基因的激活是由于對(duì)絲氨酸和蘇氨酸殘基進(jìn)行雙重磷酸化引起的[5]。p38是MAPK超家族的另一成員，MAP2K6基因是其上游的一個(gè)特異激活因子[6]，二者之間具有一定的相互作用，F(xiàn)ujishiro 等[7]研究表明，MAP2K6和p38MAPK信號(hào)通路的激活，能調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)且對(duì)胰島素信號(hào)通路具有抑制作用。根據(jù)Meng 等[8]的報(bào)道，MAP2K6及PLCB1基因共同參與促性腺激素信號(hào)通路的傳導(dǎo)，對(duì)動(dòng)物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。

在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)QTLs 的定位并進(jìn)行分子標(biāo)記是一種行之有效的重要育種手段。如Tang 等[9]通過(guò)鑒定CNN3基因的SNP 位點(diǎn)初步確定了該基因與仔豬斷奶重、出生重等生長(zhǎng)性狀有關(guān)。MAP2K6基因通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ及CEBPβ基因的表達(dá)，進(jìn)而激活p38MAPK，促進(jìn)脂肪的形成[10]，證明MAP2K6基因與牛胴體性狀具有遺傳關(guān)聯(lián)。Meng 等[8]在大白豬群體中通過(guò)GWAS方法鑒定與其生長(zhǎng)性狀相關(guān)的候選基因，結(jié)果表明在10 905 724 bp 位置處存在1 個(gè)候選基因MAP2K6，與豬的平均日增重顯著相關(guān)。因此，在本研究中將MAP2K6作為豬經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因?；贛AP2K6基因的生物學(xué)功能和QTL 定位結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)鑒定了法系大白豬群體中SNPs 位點(diǎn)并分析了豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀，期望能夠發(fā)現(xiàn)可用于育種實(shí)踐的DNA 分子標(biāo)記，為豬分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)豬群及性狀記錄 采集384 頭法系大白豬前腔靜脈血液，使用血液基因組DNA 中量提取試劑盒（離心柱型）提取樣品DNA，并于-80℃超低溫冰箱中保存。測(cè)定的表型性狀及數(shù)據(jù)收集包括達(dá)100 kg 體重日齡（d）、背膘厚（mm）、初生重（kg）、體長(zhǎng)（cm）、眼肌面積（cm2）、左乳頭數(shù)和右乳頭數(shù)。本研究用B 型超聲設(shè)備測(cè)定豬背膘厚和眼肌面積（背膘厚及眼肌面積測(cè)定位置在豬倒數(shù)第3、4 根肋骨距離背中線4～5 cm 處），測(cè)量數(shù)據(jù)由育種軟件GBS5.0 校正后得到。

1.2 法系大白豬4 個(gè)SNPs 的鑒定與分析 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找目的基因DNA 序列（XM_021068116.1），使用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增各基因所用引物及目的片段長(zhǎng)度如表1 所示。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20.0 μL：DNA模板1 μL，2×Taq PCR Mix 10.0 μL，ddH2O 8.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，退火30 s，72℃延伸，共36 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以5 μL 的DNA Marker DL2000作為參照。電泳結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.3 SNP 質(zhì)譜分型 本實(shí)驗(yàn)室委托北京康普森生物技術(shù)有限公司對(duì)MAP2K6基因的4 個(gè)突變位點(diǎn)rs345304630（SNP1）、rs325278117（SNP2）、rs332017877（SNP3）和325752048（SNP4）采用質(zhì)譜分型，檢測(cè)法系大白豬DNA 樣本。實(shí)驗(yàn)的主要流程：DNA 提取、質(zhì)檢；DNA 濃度調(diào)試；引物設(shè)計(jì)、溶解、稀釋；PCR 擴(kuò)增；PCR 產(chǎn)物堿性磷酸酶處理；單堿基延伸；樹(shù)脂純化；芯片點(diǎn)樣；質(zhì)譜檢測(cè)；統(tǒng)計(jì)基因型。

表1 MAP2K6 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用SAS 統(tǒng)計(jì)軟件中的混合線性模型（Mixed），以GLM 程序進(jìn)行基因型和性狀表型值之間的關(guān)聯(lián)分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（不同基因型表型數(shù)值間P＜0.01 判定為差異極顯著，P＜0.05 判定為差異顯著；若P＞0.05 則不顯著）。應(yīng)用Excel 軟件分別計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析其是否符合哈代-溫伯格平衡（P＞0.05表示處于遺傳平衡狀態(tài)，P＜0.05 則相反）。生長(zhǎng)性狀分析模型：

式中，Yijkl為性狀觀察值；u為性狀總平均值；Gi為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)）；Mj為年-季度效應(yīng)；Xk為性別效應(yīng)及固定效應(yīng)；Sl為父本效應(yīng)及隨機(jī)效應(yīng)；e為隨機(jī)誤差，假定服從（0，χ2）分布。

2 結(jié)果

2.1MAP2K6基因多態(tài)性檢測(cè) 測(cè)序結(jié)果表明，在法系大白豬MAP2K6基因內(nèi)含子8、內(nèi)含子11 和外顯子12區(qū)域共鑒定出4 個(gè)SNPs，包括SNP1（rs 345304630）、SNP2（rs 325278117）、SNP3（rs 332017877）和SNP4（rs 325752048）。如表2 所示，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜的方法對(duì)MAP2K6基因4 個(gè)SNPs 位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，均檢測(cè)到3 種基因型。

對(duì)MAP2K6基因多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型與法系大白豬的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，法系大白豬的SNP1 與達(dá)100 kg 體重日齡和右乳頭數(shù)性狀存在顯著相關(guān)性，AA 基因型個(gè)體達(dá)100 kg 體重日齡顯著低于AG 基因型個(gè)體，說(shuō)明AA 基因型個(gè)體具有較快的生長(zhǎng)速度；GG 基因型個(gè)體右乳頭數(shù)顯著高于AG 基因型個(gè)體；SNP2 與達(dá)100 kg 體重日齡和右乳頭數(shù)性狀存在顯著相關(guān)性。AA 基因型個(gè)體達(dá)100 kg 體重日齡顯著低于AG 基因型個(gè)體，GG 基因型個(gè)體具有較快的生長(zhǎng)速度，AA 基因型個(gè)體右乳頭數(shù)顯著高于AG基因型個(gè)體；SNP3 與達(dá)100 kg 體重日齡和右乳頭數(shù)性狀存在顯著相關(guān)性，AA 基因型個(gè)體達(dá)100 kg 體重日齡顯著低于AG 基因型個(gè)體，說(shuō)明AA 基因型個(gè)體具有較快的生長(zhǎng)速度，GG 基因型個(gè)體的右乳頭數(shù)顯著高于AG 基因型個(gè)體；SNP4 與眼肌面積存在顯著的相關(guān)性，AG 基因型個(gè)體眼肌面積顯著低于AA 基因型個(gè)體。

表2 MAP2K6 基因SNPs 基因頻率和等位基因頻率

表3 MAP2K6 基因多態(tài)性與法系大白豬經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.2 法系大白豬MAP2K6基因3 個(gè)SNPs 連鎖不平衡及單倍型分析 如圖1 所示，SNP1（rs345304630）和SNP2（rs325278117）、SNP1（rs345304630）和SNP3（rs332017877）在法系大白豬中處于完全LD（D'=1和r2=1），SNP2（rs325278117）和SNP3（rs332017877）處于強(qiáng)LD（D'=1 和r2=0.99）。如表4 所示，MAP2K6基因3 個(gè)SNPs 在法系大白豬中形成1 個(gè)單倍型模塊，共產(chǎn)生2 種單倍型，單倍型H2（AGA）的頻率均低于單倍型H1（GAG)。

圖1 法系大白豬MAP2K6 基因SNPs 連鎖不平衡區(qū)

2.3 法系大白豬MAP2K6基因單倍型組合與生長(zhǎng)育肥和乳頭數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析 由表5 可知，MAP2K6基因在法系大白豬群體中共產(chǎn)生3 種單倍型組合，單倍型組合H1-H1、H1-H2、H2-H2 與體長(zhǎng)、乳頭數(shù)、達(dá)100 kg 體重日齡、背膘厚、初生重和眼肌面積性狀有顯著關(guān)聯(lián)性。

表4 法系大白豬MAP2K6 基因單倍型頻率

2.4MAP2K6在豬各組織中差異表達(dá)分析 由圖2 可知，MAP2K6基因在法系大白豬13 個(gè)組織中表達(dá)量不同，其中在脾和脂肪中表達(dá)量最高，在肝、心、腿肌、腎、舌中的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。

3 討 論

已有研究表明，在杜洛克豬中鑒定出MAP2K6與豬的繁殖性狀有關(guān)[11]，但并沒(méi)有做進(jìn)一步研究。本研究首次在法系大白豬MAP2K6基因上發(fā)現(xiàn)4 個(gè)SNP 位點(diǎn)，與達(dá)100 kg 體重日齡、右乳頭數(shù)和眼肌面積有顯著相關(guān)；MAP2K6基因在豬各組織中的表達(dá)譜結(jié)果說(shuō)明，MAP2K6在脂肪中高表達(dá)。MAP2K6在脂肪細(xì)胞和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)中起重要作用[5,7,12]，該基因調(diào)控機(jī)體能量轉(zhuǎn)化，參與GnRH 信號(hào)通路[12]，GnRH 信號(hào)傳導(dǎo)在哺乳動(dòng)物青春期開(kāi)始時(shí)的生長(zhǎng)中也起著重要作用[13-18]。在其他動(dòng)物中，Ryu 等[19]研究表明MAP2K6基因與牛的胴體性狀（胴體重、背膘厚和大理石紋評(píng)分）具有相關(guān)性，且在該基因第1 和第11 內(nèi)含子上鑒定到4 個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中c.17-10118T＞G 多態(tài)性位點(diǎn)顯著影響牛的胴體重和大理石紋評(píng)分。豬MAP2K6可能是通過(guò)影響其胴體性狀、繁殖性狀和生長(zhǎng)性狀從而影響脂肪的形成，這還需要進(jìn)一步研究。另外，本研究出現(xiàn)這種結(jié)果可能是由于生存環(huán)境、遺傳背景、種質(zhì)特征等因素的不同，導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控差異，進(jìn)而影響MAP2K6的mRNA 表達(dá)水平。MAP2K6基因可能通過(guò)調(diào)控動(dòng)物個(gè)體的能量利用水平、激素水平等影響其生長(zhǎng)發(fā)育。因此該基因可作為研究豬生長(zhǎng)性狀的一個(gè)候選基因。目前，僅有一篇報(bào)道表明MAP2K6基因與豬的平均日增重具有相關(guān)性[8]。因此，對(duì)豬MAP2K6基因功能和SNP 的關(guān)聯(lián)仍然需要進(jìn)一步研究。

圖2 MAP2K6 基因在法系大白豬不同組織中表達(dá)差異

在本研究中，多態(tài)性位點(diǎn)rs345304630、rs325278117和rs332017877 均處于遺傳平衡狀態(tài)，并未受到遺傳漂變等外界因素的影響，這些多態(tài)性位點(diǎn)在群體中可以穩(wěn)定遺傳。豬生長(zhǎng)育肥和乳頭數(shù)性狀是受到多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，單個(gè)SNP 不足以闡明基因與性狀間的因果關(guān)系[20]。在本研究中，法系大白豬MAP2K6基因3 個(gè)SNPs（rs345304630、rs325278117 和rs332017877）處于強(qiáng)連鎖不平衡，且3 個(gè)SNPs 形成一個(gè)緊密連鎖的整體。單倍型組合與豬生產(chǎn)育肥和乳頭數(shù)性狀并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性，推測(cè)可能由于實(shí)驗(yàn)樣本量較少導(dǎo)致，下一步將擴(kuò)大樣本量檢測(cè)MAP2K6基因在不同品種豬群的多態(tài)性，為分子標(biāo)記輔助選擇和全基因組選擇提供理論依據(jù)和標(biāo)記資源。

4 結(jié) 論

本研究中，MAP2K6基因多態(tài)性位點(diǎn)SNP1（rs345304630）、SNP2（rs325278117）和SNP3（rs332017877）與法系大白豬達(dá)100 kg 體重日齡和右乳頭數(shù)顯著相關(guān)，SNP4與眼肌面積顯著相關(guān)，其中SNP1（rs345304630）和SNP3（rs332017877）多態(tài)性位點(diǎn)的AA 基因型個(gè)體生長(zhǎng)速度明顯高于AG 和GG 基因型個(gè)體，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以選擇AA 基因型個(gè)體的母豬來(lái)縮短達(dá)100 kg 體重日齡，提高經(jīng)濟(jì)效率；SNP1（rs345304630）、SNP2（rs325278117）和SNP3（rs332017877）多態(tài)性位點(diǎn)的GG 基因型個(gè)體乳頭數(shù)顯著高于AA 和AG 基因型個(gè)體，通過(guò)選擇GG 基因型個(gè)體來(lái)增加母豬的泌乳和帶仔能力，對(duì)提高哺乳仔豬的存活率和斷奶重具有重大意義。

表5 法系大白豬MAP2K6 基因二倍型與生長(zhǎng)發(fā)育及乳頭數(shù)性狀的相關(guān)性分析