邵俊紅，付俊偉，董智豪，白俊艷＊，陳夢(mèng)柯，付學(xué)言，冀 祥，韓志洪，崔晗晗，彭 彬

（1.河南省汝州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 汝州 467500；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023）

促黃體素受體 (LHR)是屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族中的糖蛋白亞家族成員，其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)有高度同源性，具有7個(gè)跨膜區(qū)、4個(gè)胞質(zhì)區(qū)以及由3個(gè)環(huán)狀區(qū)和N端組成的細(xì)胞外區(qū)，細(xì)胞外區(qū)中大約有14個(gè)不完全重復(fù)的富含亮氨酸的序列。其不但有與跨膜區(qū)發(fā)生反應(yīng)后介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的特性，而且還具有結(jié)合黃體生成素 （LH）的作用。葛立軍等[1]（2007）在多種動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、牛、火雞以及人的子宮內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有促黃體素(LH)或人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其mRNA的結(jié)合位點(diǎn)。狄冉等[2](2009)檢測(cè)了促黃體素受體(LHR)基因外顯子11在性早熟、高繁殖力山羊品種(濟(jì)寧青山羊)和性晚熟、低繁殖力品種(波爾山羊、安哥拉山羊和內(nèi)蒙古絨山羊)中的單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅引物P3和P6的擴(kuò)增片段具有多態(tài)性。申穎等[3]（2009）在探究LHR基因在濟(jì)寧青山羊發(fā)情周期的不同階段于子宮中的表達(dá)差異時(shí)，發(fā)現(xiàn)LHR mRNA在整個(gè)發(fā)情周期的子宮中都有表達(dá),但各時(shí)期表達(dá)量不同。王利紅等[4]（2011）在探究綿羊促黃體素受體基因（LHR）外顯子11多態(tài)性與繁殖性能的相關(guān)性的過程中，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的引物中只有兩個(gè)引物的擴(kuò)增片段具有多態(tài)性。本研究將PCR-SSCP技術(shù)與測(cè)序相結(jié)合，對(duì)小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊的LHR基因進(jìn)行種群內(nèi)和種群間的多態(tài)性分析，為綿羊品種的改良和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別采集來自濮陽的小尾寒羊、來自平頂山的大尾寒羊和來自偃師烏龍村的豫西脂尾羊的血樣，各48只，采用頸部靜脈采血方法，經(jīng)抗凝處理后在冰壺中低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，血樣于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。 具體為：F:5'-TCGTTTCCTCATGTGCAATCT-3'；R:5'-GGTATGCCATCTTTCTAGTGTGAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為200 bp。PCR反應(yīng)體系的總體積為15 μL，其中 1 uL 的 DNA，上、下游引物各為 1 μL,去離子水 4.5 μL， 以及 7.5 μL 的 2×Taq PCR Green Mix。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min，35×（94 ℃變性 40 s，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 80 s），72 ℃繼續(xù)延伸5 min，最后于4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，在紫外投射儀中進(jìn)行觀察，確定為陽性后在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。利用Excel軟件統(tǒng)計(jì)基因型頻率、基因頻率以及多態(tài)信息含量等相關(guān)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊LHR基因的瓊脂糖電泳結(jié)果

如圖1所示，通過梯度PCR得知，58℃是該引物的最適退火溫度。對(duì)該退火溫度下的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性擴(kuò)增良好，無拖尾，與預(yù)期片段大小200 bp相符，可進(jìn)行SSCP分析。

圖1 綿羊 LHR基因的瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果

2.2 綿羊LHR基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

對(duì)小尾寒羊、大尾寒羊、豫西脂尾羊促黃體素受體（LHR）外顯子11的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖2?？梢园l(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊中檢測(cè)到AB、BB兩種基因型，在豫西脂尾羊中檢測(cè)到AA、AB、BB三種基因型，在大尾寒羊中檢測(cè)到AB、BB兩種基因型。

圖2 綿羊LHR基因的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.3 綿羊LHR基因的群體遺傳學(xué)分析

從表1可以看出，促黃體素受體（LHR）外顯子11在小尾寒羊、大尾寒羊和豫西脂尾羊中存在三種基因型，記為AA、BB和AB。其中小尾寒羊AA的基因型頻率為0.045，AB的基因型頻率為0.295，BB的基因型頻率為0.659。豫西脂尾羊AA基因型頻率為0.174，AB的基因型頻率為0.261，BB的基因型頻率為0.565。大尾寒羊AB基因頻率為0.098，BB基因頻率為0.902。促黃體素受體（LHR）外顯子11在小尾寒羊中的遺傳雜合度（He）為0.312，有效等位基因數(shù)（Ne）為 1.452，多態(tài)信息含量（PIC）為 0.263。在豫西脂尾羊中的遺傳雜合度 （He）為0.423，有效等位基因數(shù)（Ne）為 1.734，多態(tài)信息含量（PIC）為 0.256。在大尾寒羊中的遺傳雜合度 （He）為0.093，有效等位基因數(shù)（Ne）為 1.108，多態(tài)信息含量（PIC）為 0.089。

表1 綿羊LHR基因的群體多態(tài)性分析

2.4 綿羊LHR外顯子11的測(cè)序分析

選擇LHR外顯子11的AA、AB、BB這三種基因型的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序比對(duì)結(jié)果見圖3。發(fā)現(xiàn)不同基因型之間有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，LHR在37位發(fā)生G、A的突變；在49位發(fā)生T、C的突變；在93位發(fā)生T、C突變；在139位發(fā)生T、G突變；在184位發(fā)生A、G突變。

圖3 綿羊LHR基因的不同基因型測(cè)序結(jié)果

3 討論

LHR基因是動(dòng)物體內(nèi)較為重要的調(diào)節(jié)因子之一，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都對(duì)其進(jìn)行了研究。本研究采用PCR-SSCP技術(shù)分析了小尾寒羊、豫西脂尾羊和大尾寒羊LHR基因外顯子11的多態(tài)性，SSCP結(jié)果同樣檢測(cè)到了AA、AB、BB這三種基因型。此外，寸靜宇[5]（2019）在探究綿羊LHR基因的多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其所探究的LHR基因7個(gè)SNPs在大多數(shù)綿羊品種中均表現(xiàn)為中度多態(tài) (0.25＜PIC＜0.5)，且試驗(yàn)中該基因的所有位點(diǎn)在各個(gè)綿羊品種中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)。 吳翠玲等[6]（2019）在研究新吉細(xì)毛羊中5個(gè)生殖激素受體基因的多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，LHR基因存在 T1262G、A1991G、C2012T、A2032T 和 T2041A的突變，但這些突變對(duì)其產(chǎn)仔數(shù)并無顯著影響 （P＞0.05）。關(guān)于其他物種，王愛華等[7]（2003）發(fā)現(xiàn)，豬 LHR基因外顯子11序列發(fā)生了一個(gè)堿基突變，但并沒有造成該段蛋白序列的改變，為沉默突變。以上研究都對(duì)LHR基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了部分探索，雖與本試驗(yàn)研究目的不一致，但均表明LHR基因具有較高的堿基突變概率。