吳 誠(chéng),張 娟,賈媛媛,李秋紅,孫 新

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:sunxin6@fmmu.edu.cn)

支氣管哮喘是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病,全球約有3億哮喘患者,且有一定的病死率[1]。與成人相比,哮喘在兒童中發(fā)病率更高,已成為導(dǎo)致兒童生活質(zhì)量降低的主要疾病因素[2]。據(jù)我國(guó)第三次城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,城市兒童哮喘患病率平均為3.02%,較10年前相比增加了52.8%,而且呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì),可見(jiàn)兒童哮喘是目前衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域亟待解決的難題[3]。兒童哮喘多起始于3歲前,并且年齡的增長(zhǎng)會(huì)使哮喘治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)增加。同時(shí),與無(wú)喘息癥狀的兒童相比,哮喘患兒到成年期發(fā)展為慢性阻塞性肺疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[4]。因此在兒童期對(duì)哮喘進(jìn)行有效的早期識(shí)別和防治干預(yù)是十分重要的,尤其是嬰幼兒期[5]。但是,現(xiàn)階段治療方法取得的效果并不理想,副作用較明顯,并且兒童患者的依從性較差[6]。研究發(fā)現(xiàn),哮喘的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體微生態(tài)的關(guān)系十分密切,尤其是腸道微生態(tài)。相對(duì)于健康人群,哮喘患者的腸道菌群豐度和優(yōu)勢(shì)菌群均有顯著的變化[7]。前期研究表明,益生菌能通過(guò)改善胃腸道微生態(tài)和調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)有效緩解哮喘癥狀[8]。近年來(lái),作為重建腸道菌群的有效手段,糞菌移植已被用于難辨梭狀芽孢桿菌感染、腸道免疫缺陷、炎癥性腸病、腸道過(guò)敏、頑固性便秘和代謝病等多種疾病的探索性研究和臨床治療,并取得了較好的療效[9-12]。糞菌移植是指將健康宿主糞便中的有效菌群移植到患者胃腸道內(nèi),重建新的腸道菌群生態(tài),以實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道及腸道外疾病的治療方法[13]。然而目前針對(duì)糞菌移植在哮喘中的作用及機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)建立哮喘幼鼠模型,觀察糞菌移植對(duì)過(guò)敏性哮喘氣道炎癥的影響,并探討其作用機(jī)制,以期為哮喘研究提供新的方向和防治策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2周孕齡的BALB/c小鼠,體質(zhì)量55-59 g,購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)2019-001。孕鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組,哮喘模型組和糞菌移植組,每組各2只。

1.2 主要試劑和儀器

卵清蛋白(ovalbumin,OVA,Grade V,美國(guó)Sigma公司);氫氧化鋁[Al(OH)3]粉末(天津天士力化學(xué)試劑公司);乙酰甲膽堿(acetyl-β-methylcholinechloride,Mch,美國(guó)Sigma公司);Ⅳ型膠原酶(德國(guó)biofroxx公司);流式細(xì)胞染色緩沖液(美國(guó)eBioscience公司);小鼠IL-4、IL-5、IL-13 ELISA試劑盒(美國(guó)Sabbiotech公司);空氣壓縮霧化器(大連歐姆龍有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng));小鼠肺功能儀(加拿大SCIREQ公司);自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur(美國(guó)BD Biosciences)。

1.3 孕鼠飼養(yǎng)

BALB/c小鼠于孕2周時(shí)購(gòu)入,置于動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)至自然分娩,正常供給飲食飲水。孕鼠生仔后,正常對(duì)照組有13只新生鼠,模型有15只新生鼠,糞菌移植組有12只新生鼠。小鼠均飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,恒定室溫(21-25 ℃),濕度50%-65%,光照12 h/d,小鼠自由進(jìn)食進(jìn)水,飼養(yǎng)過(guò)程遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物保護(hù)和使用指南,實(shí)驗(yàn)中遵循“3R原則”,并且所有操作均嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》。

1.4 建立哮喘模型

在模型組和糞菌移植組小鼠出生后的第0天、第7天和第14天采用含10 μg OVA和1 mg Al(OH)3的生理鹽水配成20 μl致敏液進(jìn)行腹腔注射致敏,并于第21-28天用1%OVA霧化液霧化吸入激發(fā),隔天1次,每次30 min。對(duì)照組采用不含OVA、僅含Al(OH)3的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射,并用生理鹽水霧化,其他條件不變,研究技術(shù)路線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

圖1 研究技術(shù)路線(xiàn)圖

1.5 糞菌移植

生后第21-28天每日08:00,取對(duì)照組幼鼠新鮮糞便,按比例(W/V=1 ∶5)溶于無(wú)菌生理鹽水中,攪勻制成混懸液。懸液經(jīng)20 mm孔徑的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾后,于4 ℃ 6 000g離心5 min,溶解在生理鹽水中制成400 mg/ml的菌液。于10:00給予糞菌移植組幼鼠150 μl菌液灌胃,正常對(duì)照組和模型組給予等量無(wú)菌生理鹽水灌胃。

1.6 霧化刺激法測(cè)定氣道高反應(yīng)性

小鼠在末次霧化激發(fā)24 h后,經(jīng)2%戊巴比妥鈉溶液(0.045 ml/g)腹腔注射麻醉進(jìn)行氣管插管,將其連接于小鼠肺功能儀上,依次霧化吸入濃度為0,1.5,3,6,12,25,50,100 mg/ml的乙酰甲膽堿(Mch),記錄小鼠氣道總阻力值(Rrs)。

1.7 光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中白細(xì)胞及分類(lèi)細(xì)胞百分比

小鼠經(jīng)麻醉后仰臥位固定,分離頸部組織暴露氣管,進(jìn)行氣管插管并固定。用4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,每次注入0.6 ml,停留20 s后回抽(回抽率>80%),重復(fù)3次,記錄回收量。將收集的肺泡灌洗液(BALF)于4 ℃ 2 500 r/min離心5 min,離心后的上清保存于-80 ℃?zhèn)溆?沉淀則用1 ml無(wú)菌PBS溶液重懸,取100 μl重懸液涂片,進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色,在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù),并計(jì)算各分類(lèi)細(xì)胞百分比。

1.8 肺組織病理切片染色

支氣管肺泡灌洗完畢后,解剖暴露小鼠肺部,取小鼠左肺下葉,并浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定,經(jīng)酒精脫水、石蠟包埋后切片,進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.9 ELISA法檢測(cè)BALF中的炎性細(xì)胞因子

根據(jù)ELISA試劑盒操作說(shuō)明對(duì)BALF上清中的IL-4、IL-5和IL-13細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè),并在450 nm處使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,計(jì)算轉(zhuǎn)換為相應(yīng)濃度。

1.10 流式檢測(cè)Tregs比例

無(wú)菌操作打開(kāi)胸腔,取出肺臟并用眼科剪剪碎后,加入1 ml含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基和Ⅳ型膠原酶(1 mg/ml,3 ml/只),于37 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)150 r/min消化1 h。用70 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾后,4 ℃ 1 500 r/min離心15 min,收集肺組織細(xì)胞團(tuán),加入1 ml紅細(xì)胞裂解液反應(yīng)5 min。再次離心10 min,用PBS清洗兩遍并重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為(2-4)×107/ml,每管100 μl,制成肺組織單細(xì)胞懸液。加入CD4-FITC(美國(guó)eBioscience公司)、CD25-APC(美國(guó)eBioscience公司),冰上避光孵育15-20 min,用流式液清洗2次,350g離心5 min,留沉淀。在每管中加入1 ml固定破膜液反應(yīng)30-60 min后,再加入2 ml破膜工作液清洗2次,離心后留沉淀。100 μl破膜工作液重懸細(xì)胞,加入Foxp3-PE(美國(guó)eBioscience公司)室溫避光孵育30 min。流式液清洗2次,再次離心取沉淀,用流式液重懸細(xì)胞至200 μl,上機(jī)檢測(cè)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 幼鼠行為學(xué)觀察

在造模霧化過(guò)程中,模型組小鼠出現(xiàn)明顯的焦躁不安、情緒激動(dòng)、全身瘙癢、抓臉擦鼻、呼吸加快、打噴嚏、毛發(fā)豎起、腹肌抽搐等哮喘速發(fā)相表現(xiàn),而對(duì)照組及糞菌移植組小鼠活動(dòng)正常,無(wú)上述異常表現(xiàn)。

2.2 氣道高反應(yīng)性

小鼠氣道阻力隨著吸入Mch濃度的增加而逐漸增高。與對(duì)照組相比,模型組小鼠在25,50,100 mg/ml Mch時(shí)氣道阻力顯著升高(P<0.000 1);與模型組相比,糞菌移植組在25,50,100 mg/ml Mch時(shí)氣道阻力顯著降低(P<0.05-0.000 1,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.000 1

2.3 肺組織病理染色

蘇木精-伊紅(HE)染色法可觀察到炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。通過(guò)三組小鼠肺組織染色結(jié)果的對(duì)比發(fā)現(xiàn),對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,氣道周?chē)鸁o(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損,肺泡壁斷裂,細(xì)小支氣管周?chē)忻黠@的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);糞菌移植組小鼠肺部炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕,肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也明顯較少(見(jiàn)圖3)。

圖3 小鼠肺組織HE染色(HE染色,×200)

2.4 BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)細(xì)胞百分比

與對(duì)照組相比,模型組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)明顯增多(P<0.001),主要表現(xiàn)為嗜酸粒細(xì)胞(P<0.000 1)和中性粒細(xì)胞(P<0.01)增多,淋巴細(xì)胞(P<0.001)和巨噬細(xì)胞(P<0.05)降低;與模型組小鼠相比,糞菌移植組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)顯著降低,其中嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著減少(P<0.001),淋巴細(xì)胞(P<0.001)和巨噬細(xì)胞(P<0.05)明顯升高(BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)細(xì)胞百分比分別見(jiàn)圖4,5)。

與對(duì)照組相比,***P<0.001;與模型組相比,###P<0.001

2.5 BALF中細(xì)胞因子水平變化

與對(duì)照組相比,模型組小鼠BALF中炎性細(xì)胞因子IL-4(P<0.000 1)、IL-5(P<0.01)和IL-13(P<0.05)水平顯著升高;與模型組相比,糞菌移植組BALF中IL-4(P<0.000 1)、IL-5(P<0.01)和IL-13(P<0.01)水平顯著降低(見(jiàn)圖6)。

與對(duì)照組相比,**P<0.01,***P<0.000 1;與模型組相比,##P<0.01,###P<0.001

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.000 1

2.6 小鼠肺組織中Tregs比例變化

與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中的Tregs在CD4+T細(xì)胞中的比例明顯下降(P<0.05);與模型組相比,糞菌移植組小鼠肺組織中Tregs在CD4+T細(xì)胞中的比例顯著升高(P<0.05,見(jiàn)圖7,8)。

圖7 小鼠肺組織中Tregs的流式圖

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病,以氣道高反應(yīng)性、可逆性的氣流受限和多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征。目前,哮喘僅能經(jīng)藥物治療以控制癥狀,尚不能被完全治愈,且發(fā)病機(jī)制仍未被完全闡明。因此,對(duì)兒童期哮喘的發(fā)病機(jī)制和治療新靶點(diǎn)新途徑的深入研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明,過(guò)敏性哮喘患者呼吸道炎癥的病理改變以嗜酸粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、2型輔助性T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)的活化和血清免疫球蛋白(IgE)的升高為主[14]。Th1/Th2細(xì)胞失衡被普遍認(rèn)為是哮喘的免疫學(xué)發(fā)病基礎(chǔ),表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞功能亢進(jìn)和Th1細(xì)胞功能降低,而炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13則主要是由Th2細(xì)胞所分泌[15,16]。哮喘的發(fā)病因素十分多樣,其中環(huán)境因素也發(fā)揮重要作用,而腸道微生物觸發(fā)因子作為一個(gè)重要的環(huán)境因子,在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[17]。而糞菌移植即是通過(guò)將健康供體的微生物群轉(zhuǎn)移到一個(gè)紊亂的微生物生態(tài)系統(tǒng)中,調(diào)控胃腸道微生物群以恢復(fù)穩(wěn)態(tài),是一種相對(duì)直接的干預(yù)治療方法[18]。糞菌移植作為近年來(lái)新興的治療方式,在各類(lèi)菌群相關(guān)性疾病的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中起到一定的治療作用。有文章從不同角度對(duì)糞菌移植在哮喘的控制和治療方面的理論可行性進(jìn)行了闡釋,但罕有報(bào)道將其付諸具體研究[19]。本研究結(jié)果顯示,相比于模型組,糞菌移植可以減輕哮喘幼鼠肺部的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),降低氣道高反應(yīng)性,減少BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,并且BALF中的炎性因子IL-4、IL-5和IL-13水平也明顯下降,提示糞菌移植能夠有效抑制哮喘幼鼠的Th2型免疫反應(yīng),具有較好的治療作用。

Tregs是一類(lèi)主要發(fā)揮抑制性免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細(xì)胞亞群,在維持免疫耐受、限制慢性炎癥、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20-22]。Tregs可通過(guò)表達(dá)膜結(jié)合性或可溶性抑制分子,或分泌抑制性細(xì)胞因子(如IL-10、IL-35和TGF-β),對(duì)過(guò)敏性炎癥起到抑制作用[23]。腸道微生物可通過(guò)菌群自身或者其代謝產(chǎn)物影響Tregs的數(shù)量和功能,進(jìn)而促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子的分泌以調(diào)控體內(nèi)免疫狀態(tài),這種作用在對(duì)哮喘的保護(hù)中同樣出現(xiàn)[24]。本研究結(jié)果表明,糞菌移植干預(yù)能有效增加肺組織中Tregs在CD4+T細(xì)胞中的比例,提示糞菌移植可通過(guò)誘導(dǎo)肺組織Tregs的產(chǎn)生,促進(jìn)Tregs表達(dá)抗炎因子,抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和Th2型細(xì)胞因子的大量分泌,進(jìn)而減輕肺部和氣道的過(guò)敏性炎癥。

綜上所述,通過(guò)給予糞菌移植干預(yù),哮喘幼鼠的氣道過(guò)敏性炎癥明顯減輕,BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)量和Th2型細(xì)胞因子表達(dá)顯著減少,同時(shí)糞菌移植能夠誘導(dǎo)肺組織中Tregs的產(chǎn)生,促進(jìn)免疫負(fù)調(diào)控功能的表達(dá)并發(fā)揮抗炎作用,對(duì)過(guò)敏性哮喘具有一定的治療效果,為哮喘的治療提供新的思路和方法。