王永安，李亞蘭，吳佳佳，葛東宇，彭桂英

基于16S rDNA分析大承氣湯對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠腸道菌群的影響

王永安1，李亞蘭1，吳佳佳1，葛東宇2，彭桂英1

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

通過(guò)16S rDNA測(cè)序探討大承氣湯對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠腸道菌群的影響。SPF級(jí)C57BL/6 雌性小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、大承氣湯組和地塞米松組。采用卵清蛋白-氫氧化鋁法制備過(guò)敏性哮喘小鼠模型，成模后進(jìn)行肺組織病理切片PAS染色，取糞便提取DNA進(jìn)行高通量16S rDNA測(cè)序分析及菌群選擇性培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺指數(shù)明顯升高（＜0.001），肺泡結(jié)構(gòu)消失，支氣管及血管周?chē)罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，氣管內(nèi)大量黏蛋白分泌；與模型組比較，大承氣湯組小鼠肺指數(shù)明顯下降，肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，氣管內(nèi)黏蛋白分泌量明顯減少。腸道菌群物種組成分析顯示，模型組小鼠乳桿菌屬和螺桿菌屬含量下降，大承氣湯組含量增加；模型組小鼠擬普雷沃菌屬含量增加，大承氣湯組含量下降。模型組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照組明顯不同，大承氣湯組菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)；腸道菌群選擇性培養(yǎng)結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌數(shù)量顯著增加（＜0.001，＜0.01），大承氣湯組顯著減少（＜0.01，＜0.05）；模型組小鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量顯著減少（＜0.01），大承氣湯組明顯增加（＜0.01）。大承氣湯可降低哮喘小鼠腸道大腸桿菌和腸球菌含量、提高乳酸桿菌含量，恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)。

過(guò)敏性哮喘；大承氣湯；腸道菌群；16S rDNA測(cè)序；小鼠

過(guò)敏性哮喘是由氣道上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的，以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，臨床表現(xiàn)為喘息、氣促、胸悶及咳嗽等多變的呼吸道癥狀伴可逆的呼氣氣流受限，屬中醫(yī)學(xué)“哮證”“喘證”范疇。西醫(yī)治療以糖皮質(zhì)激素為主，但不良反應(yīng)較多，如口腔念珠菌病、聲音嘶啞、咽炎等[1]。近年來(lái)許多哮喘與腸道菌群相關(guān)研究顯示，腸道與呼吸道在生理與病理上關(guān)系密切[2-3]。研究表明，成年人中過(guò)敏性哮喘患者糞便菌群整體組成與健康個(gè)體不同[4]。中醫(yī)治療過(guò)敏性哮喘具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。大承氣湯出自《傷寒雜病論》，是從腸治肺的代表方。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯可改善哮喘小鼠肺組織炎癥，抑制MAPK信號(hào)通路激活[5-6]，但其機(jī)制是否與作用于腸道菌群、改變菌群群落組成有關(guān)，迄今尚未明確。因此，本研究從分析腸道菌群出發(fā)，進(jìn)一步探討大承氣湯對(duì)哮喘小鼠療效的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雌性C57BL/6小鼠24只，SPF級(jí)，6～8周，體質(zhì)量18 g以上，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境，最大溫差不超過(guò)4 ℃，噪音小于60 db，每小時(shí)保持通風(fēng)換氣數(shù)次，光照12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥物及制備

大承氣湯（大黃12 g，枳實(shí)12 g，厚樸24 g，芒硝9 g，此為臨床成人藥量），飲片購(gòu)自北京同仁堂總店，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王秀麗副教授鑒定為正品。藥物浸泡30 min，先武火煎煮10 min，再文火煎煮20 min，煎煮2次，合并煎液，水煎濃縮至含原藥材1.9 g/mL，將所得藥液用雙層紗布過(guò)濾，置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。小鼠給藥量按體表面積換算，給予臨床等效劑量。地塞米松片，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)1705016；將地塞米松片研成粉末溶于生理鹽水，每日藥量為5 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

卵清蛋白（OVA，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)41235），10×PBS（美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)1627690），氫氧化鋁凝膠（40 mg/mL，50 mL，德國(guó)Thermo公司，貨號(hào)77161）。PAS染色試劑盒（美國(guó)Solarbio公司，貨號(hào)G1340）。TPY培養(yǎng)基、MRSA培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），KV培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），EMB培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），BEA培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）。醫(yī)用霧化器（PARI Turbo BOY N），天平（ACS-3C型，廣州中山市新和基科技開(kāi)發(fā)有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DCG-9140B型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），5415型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），2.5 L三菱MGC圓底立式培養(yǎng)袋、三菱MGC厭氧產(chǎn)氣袋、37 ℃普通培養(yǎng)箱、Ⅱ級(jí)生物安全柜（日本三菱公司），HM325型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Microm公司）。

1.4 分組、造模及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組、模型組、大承氣湯組和地塞米松組，每組6只。采用OVA誘導(dǎo)制備過(guò)敏性哮喘小鼠模型[7]。全程分為2個(gè)階段。①2次致敏：分別于第0、14日，模型組和給藥組每只小鼠腹腔注射0.2 mL抗原液（每0.2 mL含2 mg 氫氧化鋁、20 μg OVA），對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水處理。②霧化激發(fā)：自造模第21日開(kāi)始，將小鼠置于霧化箱中，模型組和給藥組小鼠霧化吸入1%OVA激發(fā)，對(duì)照組小鼠給予生理鹽水霧化，1次/d，30 min/次，連續(xù)7 d。從第21日起，霧化前1 h，大承氣湯和地塞米松組分別給予大承氣湯和地塞米松灌胃，每只0.2 mL，對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 肺指數(shù)

稱(chēng)重后脫頸處死小鼠，打開(kāi)胸腔取出肺臟，摘除氣管、肺門(mén)淋巴結(jié)等組織，吸干肺臟表面血液，稱(chēng)取肺臟質(zhì)量。計(jì)算肺指數(shù)。肺指數(shù)（%）＝肺質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。

1.5.2 肺組織形態(tài)

取肺組織，10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片（厚約5 μm，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切3張），PAS染色，中性樹(shù)膠封片后，鏡下觀察肺組織形態(tài)。

1.5.3 腸道菌群16S rDNA測(cè)序分析

收集對(duì)照組、模型組、大承氣湯組小鼠糞便樣本，-80 ℃冰箱保存。樣品16S rDNA檢測(cè)由北京奧維森基因科技有限公司完成，選取細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增與測(cè)序。引物序列：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R，5’-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3’。擴(kuò)增反應(yīng)體系：FastPfu Buffer（5×）4 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、Forward Primer與Reverse Primer各0.8 μL、DNA模板10 ng、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL，最后加ddH2O至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；（95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s）×30；72 ℃，10 min。每個(gè)樣本5個(gè)重復(fù)，將同一樣本PCR產(chǎn)物混合，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。構(gòu)建Illumina平臺(tái)文庫(kù)，進(jìn)行Illumina測(cè)序。按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。分析前先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，再進(jìn)行序列拼接，得到優(yōu)化序列。再去除嵌合體序列后進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析，對(duì)OTU代表序列作分類(lèi)學(xué)分析。基于OTU聚類(lèi)分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析及測(cè)序深度檢測(cè)；基于分類(lèi)學(xué)信息，在各分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析。在上述分析基礎(chǔ)上，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

1.5.4 平板菌落計(jì)數(shù)

利用選擇鑒別培養(yǎng)基，采用平板活菌計(jì)數(shù)法對(duì)腸道主要固有菌群進(jìn)行定性、定量分析。根據(jù)培養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)配制培養(yǎng)基，高壓滅菌后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，冷卻后放置4 ℃留用。取0.1 g近結(jié)腸端糞便，加入1 mL無(wú)菌生理鹽水，混合均勻，按10-1、10-2、10-3……10-9進(jìn)行樣本稀釋?zhuān)瑢颖鞠♂屢悍謩e滴在培養(yǎng)基上，再用涂布棒涂布均勻，每個(gè)稀釋度接種3塊培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)時(shí)取菌落平均數(shù)。EMB、BEA培養(yǎng)基置37 ℃孵育24 h，TPY、MRSA、KV培養(yǎng)基放入培養(yǎng)袋，將厭氧產(chǎn)氣袋投入培養(yǎng)袋，封閉，37 ℃孵育48 h。觀察菌落特征，計(jì)算活菌數(shù)，革蘭氏染色初步鑒定目的菌群。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大承氣湯對(duì)哮喘小鼠肺指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.001）；與模型組比較，大承氣湯組和地塞米松組小鼠肺指數(shù)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺指數(shù)比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，***＜0.001；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.2 PAS染色結(jié)果

對(duì)照組小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔厚度正常，黏膜下及氣管周?chē)匆?jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)不清晰，支氣管及血管周?chē)罅垦准?xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)有大量分泌物，可見(jiàn)黏液栓，支氣管壁略顯增厚；大承氣湯組和地塞米松組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，氣管內(nèi)黏液分泌量明顯下降。見(jiàn)圖1。

注：紅色箭頭所指為氣道中分泌黏蛋白

2.3 16S rDNA測(cè)序結(jié)果

造模后收集小鼠糞便，每組隨機(jī)選擇5只小鼠，提取總DNA進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析。得到各樣本平均reads數(shù)目為39 167個(gè)，OTUs數(shù)目為531個(gè)。3組共有OTUs數(shù)為373個(gè)，對(duì)照組、模型組和大承氣湯組獨(dú)有OTUs數(shù)分別為20、11、42個(gè)；對(duì)照組與模型組共有OTUs數(shù)為24個(gè)，對(duì)照組與大承氣湯組共有OTUs數(shù)為33個(gè)，模型組與大承氣湯組共有OTUs數(shù)為28個(gè)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組OTU分布韋恩圖

Chao1指數(shù)即菌種豐富度指數(shù)，用以估計(jì)群落中OTU數(shù)目。Shannon指數(shù)是用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。與對(duì)照組比較，模型組小鼠腸道菌群Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均升高，經(jīng)大承氣湯治療后下降。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠腸道菌群alpha多樣性分析

根據(jù)分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，可得知一個(gè)或多個(gè)樣本在各分類(lèi)水平上的分類(lèi)學(xué)比對(duì)情況。在屬水平上，與對(duì)照組比較，模型組小鼠乳桿菌屬和螺桿菌屬含量下降，大承氣湯組含量均增加；模型組小鼠擬普雷沃菌屬含量增加，大承氣湯組含量下降。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠腸道菌群屬水平物種組成分析

主成分分析（PCA）是一種對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的技術(shù)，通過(guò)分析不同樣本OTU（97%相似性）組成可反映樣本間的差異和距離，樣本組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。圖5中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離代表樣品間物種組成的相似度，圖中對(duì)照組與模型組菌群結(jié)構(gòu)差異明顯，而大承氣湯組菌落結(jié)構(gòu)向?qū)φ战M靠近。

圖5 各組小鼠腸道菌群PCA分析

2.4 大承氣湯對(duì)哮喘小鼠腸道5種固有菌群數(shù)量的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌數(shù)量顯著增加（＜0.001），乳酸桿菌數(shù)量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，大承氣湯組小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌數(shù)量顯著減少（＜0.01，＜0.05），乳酸桿菌數(shù)量顯著增加（＜0.01）。這與測(cè)序結(jié)果基本一致。各組雙歧桿菌、擬桿菌數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腸道固有菌群菌落數(shù)比較（±s，lgCFU/g）

注：與對(duì)照組比較，**＜0.01，***＜0.001；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

3 討論

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)經(jīng)典理論，具有豐富的內(nèi)涵。研究表明，肺部與腸道除在胚胎發(fā)育及生理功能上有相近之處外，許多肺腸疾病的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系[8]。大承氣湯為攻下通腑之方，能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，使胃腸氣機(jī)得以通降，腑氣通暢，則肺氣得以宣發(fā)。本研究以O(shè)VA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠為動(dòng)物模型，觀察大承氣湯對(duì)模型小鼠腸道菌群的影響。前期研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯能改善OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺部炎癥病理，降低血清IgE水平[6，9]。本研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯治療后哮喘小鼠肺指數(shù)下降，肺組織PAS染色顯示，大承氣湯對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠肺部炎癥及氣管黏蛋白過(guò)量分泌有明顯的改善作用，與上述研究結(jié)果一致。

肺部疾病在一定程度上可影響腸道病理生理狀態(tài)。Hijazi等[10]研究表明，過(guò)敏性哮喘兒童患者腸黏膜通透性明顯高于健康兒童。腸道菌群是機(jī)體消化系統(tǒng)微環(huán)境的重要組成部分，與許多疾病尤其是過(guò)敏性疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究表明，腸道菌群可參與肺部免疫調(diào)節(jié)和機(jī)體防御[11]。Trompette等[12]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群對(duì)膳食纖維的代謝能影響氣道過(guò)敏反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)敏性哮喘小鼠腸道菌群菌落組成結(jié)構(gòu)與對(duì)照組明顯不同，經(jīng)大承氣湯治療后，腸道菌群結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。大腸桿菌是腸道中一類(lèi)機(jī)會(huì)致病性細(xì)菌。Jong等[13]發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏性哮喘患者病重程度與大腸桿菌入血指數(shù)呈正相關(guān)。乳酸桿菌是常見(jiàn)的腸道益生菌。Wu等[14]發(fā)現(xiàn)，LGG（Lactobacillus rhamnosus GG）能明顯改善OVA誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)氣道重構(gòu)和膠原蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)敏性哮喘小鼠腸道大腸桿菌數(shù)量明顯增加，乳酸桿菌數(shù)量明顯下降，經(jīng)大承氣湯治療后，大腸桿菌數(shù)量明顯下降，乳酸桿菌數(shù)量明顯增加，與上述相關(guān)研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠存在腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的改變，尤其大腸桿菌和腸球菌明顯增加，乳酸桿菌減少，大承氣湯可糾正哮喘小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的改變，這可能是大承氣湯發(fā)揮治療哮喘小鼠療效的作用機(jī)制。然而，大承氣湯對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用是否為其療效作用的關(guān)鍵，尚需使用廣譜抗生素清除腸道菌群或利用無(wú)菌動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)。此外，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物是如何影響哮喘小鼠肺部免疫功能和穩(wěn)態(tài)的，均值得進(jìn)一步研究。

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Effects ofDecoction on Intestinal Flora in Allergic Asthmatic Mice Based on 16S rDNA Sequencing

WANG Yong’an1, LI Yalan1, WU Jiajia1, GE Dongyu2, PENG Guiying1

To investigate the effects ofdecoction on intestinal flora in allergic asthmatic mice through 16S rDNA sequencing.SPF C57BL/6 female mice were randomly divided into control group, model group,Decoction group and dexamethasone group. The allergic asthma murine model was established by immunizing with ovalbumin and Al(OH)3mixture. At the end of the experiment, lungs were dissected for PAS staining and feces were collected for 16S rDNA sequencing as well as bacterial selective culture and microbial community count.Compared with control group, the lung index of mice in the model group significantly increased (<0.001), the alveolar structure disappeared, a large number of inflammatory cells infiltrated the bronchus and blood vessels, and a large amount of mucin was secreted in the trachea. Compared with the model group, the lung index of theDecoction group significantly decreased(<0.05), the alveolar structure was clearer, the inflammatory cell infiltration was significantly reduced, and the mucin secretion in the trachea was significantly reduced. The analysis of the species composition of the intestinal flora showed that the content ofandin the model group decreased, and the content increased inDecoction group; the content ofin the model group increased, but decreased inDecoction group. The community composition of intestinal microbiota from mice in the model group was significantly different from that of the control group, and the flora structure recovered inDecoction group; The results of selective culture of intestinal flora showed that the number of intestinalandin the model group mice increased significantly (<0.001,<0.01), and significantly decreased inDecoction group (<0.01,<0.05); the number of lactobacilli in the intestines of mice in the model group decreased significantly (<0.01), and increased significantly inDecoction group (<0.01).Decoction can reduce the content ofandin the intestinal tract of asthmatic mice, increase the content of lactobacilli, and restore the communities of the intestinal flora.

allergic asthma;Decoction; intestinal flora; 16S rDNA sequencing; mice

R285.5

A

1005-5304(2021)02-0076-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202008445

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473656）；北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2019-JYB-TD014）

（收稿日期：2020-08-28）

（修回日期：2020-09-16；編輯：華強(qiáng)）