李 紅,張 云,付丙月,鮮 婧,張相軍,王金虎,石海英
(山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東 濟(jì)南 250101)
常見的心血管疾病有心臟病、高血壓和腦血栓[1]。治療血栓性心血管疾病,通常采用藥物治療,包括抗凝治療,如肝素;抗血小板活化治療,如阿司匹林;抗缺血治療,包括β-受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑與汀類藥物等[2]。已有研究表明,血管損傷破裂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷,可激活血小板處于亢進(jìn)狀態(tài),進(jìn)而誘發(fā)血栓,因此,抗血小板聚集藥物是治療心血管疾病的有效手段[3]。
丹參是一種名貴的傳統(tǒng)中藥材,廣泛用于多種疾病的預(yù)防和輔助治療,如保護(hù)心臟,預(yù)防心腦血管疾病,抗氧化作用等[4]。復(fù)方丹參滴丸(CDDP)是一種廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)藥物,用于血栓性疾病的臨床治療,能促進(jìn)血液循環(huán)和清除血瘀[5-6]。丹酚酸(salvianolic acid,SA,結(jié)構(gòu)見圖1)是丹參中有抗氧化作用的化合物之一,已有研究表明,丹酚酸有多種藥理活性,包括抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和防止血栓形成等藥理作用[7-8]。已有研究報(bào)道丹酚酸有高效的抗血小板作用,通過調(diào)節(jié)有抗血小板作用的聚集抑制分子cAMP而達(dá)到抑制血小板聚集的目的[9-13]。本文主要研究丹酚酸6種化合物體外對腺苷-5'二磷酸(adenosine-5-diphosphate,ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集的作用,為后續(xù)研究提供依據(jù)。
圖1 丹酚酸A(SAA)及其二相代謝物A1~A4及丹酚酸B(SAB)化學(xué)結(jié)構(gòu)
Agilent 1100 高效液相色譜儀,包括在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二元高壓泵和VWD檢測器(美國安捷倫);TGL-20W 臺式高速冷凍離心機(jī)(湘儀儀器);KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器);移液槍(德國賽多利斯公司);DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特);普利生LBY-NJ4型血小板聚集儀(北京普利生);飛鴿牌TGL-16G高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);血小板聚集儀配套設(shè)備(比濁杯,磁力攪拌子,墨盒,北京普利生);一次性使用無菌注射器(新華安得);MS105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
6種丹酚酸(均為本實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC純度>90 %,SAA、SAB、A1、A2、A3、A4批號分別為20180101,20180102,20180103,20180104,20180105,20180106);腺苷二磷酸(ADP,美國Sigma公司);替格瑞洛(麥克林試劑);水合氯醛(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑);無水氯化鈣,葡萄糖,生理鹽水(山東魯抗辰欣);乙腈(Fisher Chemical);其余試劑均為國產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
雄性健康清潔級SD大鼠,體重 220 g±20 g,由山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評價(jià)中心提供,審核合格。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。
丹酚酸樣品采用Agilent 1100高效液相色譜儀,采用YMC-Pack ODS-A-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,柱溫25 ℃,流動(dòng)相為乙腈-0.01 %磷酸水(55:45),流速1.0 ml/min,檢測波長263 nm,進(jìn)樣量20 μl,檢測樣品純度。
取健康的雄性SD大鼠,體重約220±20 g,腹腔注射10 %水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后,按抗凝劑與血液的容積比1:9加入3.8%枸櫞酸鈉,采血管與離心管等均用抗凝劑潤管,輕輕搖勻,使抗凝劑與血液充分地混勻,防止其凝固。
采用一次離心法,于22 ℃、1500 r/min離心6 min,取上清即為富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP),其余標(biāo)本以8000 r/min離心15 min,即為貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。重復(fù)離心兩次。將PRP與PPP均置于37 ℃,并加蓋保存,時(shí)間不超過2 h。
用貧血小板血漿調(diào)整富血小板血漿中的血小板數(shù)目為3×108個(gè)/ml,向已調(diào)好數(shù)目的300 μl富血小板血漿中加入2 mol/L無水氯化鈣溶液40 μl,5 %葡萄糖溶液20 μl,20 μl空白溶媒,攪拌混勻,37 ℃保溫5 min,用貧血小板血漿調(diào)零,加入 50 μl ADP誘導(dǎo)劑,其終濃度為50 μmol/L,以誘導(dǎo)血小板聚集,比濁法測定血小板聚集率,作為對照組。
取不同濃度的對照藥物替格瑞洛及丹酚酸化合物代替上述空白溶媒,按上述步驟加到富血小板血漿中,檢測血小板聚集率。檢測結(jié)果用血小板最大聚集率表示。
在給定的色譜條件下,采用乙腈-水體系,根據(jù)分離度和峰型等的差異,選擇適當(dāng)比例的流動(dòng)相分離丹酚酸類化合物,結(jié)果見表1。測定結(jié)果表明,HPLC法專屬性好靈敏度高,各化合物純度均大于95 %,純度檢查符合實(shí)驗(yàn)要求。
表1 人參皂苷原型化合物純度檢查結(jié)果
建立大鼠洗滌血小板體外模型,以ADP為誘導(dǎo)劑,替格瑞洛為陽性對照藥,考察丹酚酸類化合物體外對血小板聚集的作用,采用比濁法測定其在5 min內(nèi)的血小板聚集率,平行6次,結(jié)果用IC50表示。利用丹酚酸與血小板相互作用的評價(jià)體系,測定了陽性對照藥物替格瑞洛的IC50值為1.9 nmol/L,與文獻(xiàn)的報(bào)道值在一個(gè)數(shù)量級以內(nèi)[3],表明本實(shí)驗(yàn)所建立的評價(jià)系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。在相同的評價(jià)系統(tǒng)內(nèi),分別測定了6種丹酚酸類化合物與血小板的體外相互作用。結(jié)果見圖2。
圖2 丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的體外大鼠血小板聚集作用的劑量反應(yīng)曲線
如圖2所示,6種丹酚酸類化合物對體外ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用的劑量反應(yīng)曲線在形狀上沒有顯著區(qū)別,均呈劑量依賴性,且為正相關(guān),即隨著丹酚酸類化合物量的增加,其抑制血小板聚集的活性也同樣增加。丹酚酸類化合物對血小板聚集的抑制作用表現(xiàn)出不同的作用程度,計(jì)算丹酚酸類化合物對血小板聚集抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC50值),用于定量表達(dá)其作用效力,見表2。由表2可見,丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的體外大鼠血小板聚集作用的結(jié)果表明,IC50值為0.3~0.9 mmol/L,在mmol/L數(shù)量級上,抑制作用溫和,推測其副作用較小,有研究價(jià)值。丹酚酸對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的效力不同,但抑制作用差別不大,推測可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),此處尚未進(jìn)行其作用機(jī)制的分析與討論。
表2 丹酚酸和替格瑞洛對ADP誘導(dǎo)的體外大鼠血小板聚集的影響
本文建立了靈敏、快速、準(zhǔn)確的體外血小板聚集評價(jià)系統(tǒng),研究了丹酚酸等6種化合物對體外血小板聚集的影響,結(jié)果穩(wěn)定可靠。結(jié)果表明,丹酚酸表現(xiàn)出中等的體外抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用。丹酚酸對血小板聚集的抑制作用較溫和,對于慢性病長期用藥的治療有一定意義,且有很好的研究價(jià)值。