朱 珠 施 怡 鈕曉紅 高金輝 傅良杰 薛倩一

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210014）

結(jié)核病在全球范圍內(nèi)仍威脅著人類的健康。2019年，我國統(tǒng)計(jì)報(bào)告了結(jié)核病新發(fā)患者86.6萬余例[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肺外結(jié)核占所有結(jié)核病總數(shù)的20%～50%[2]，肺外結(jié)核患者中約有50%可發(fā)生結(jié)核性創(chuàng)面[3]，其中淋巴結(jié)核創(chuàng)面占比最 高[4]86。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫的重要防線，吞噬入侵的結(jié)核分枝桿菌（MTB）[5]，引發(fā)細(xì)胞凋亡。澤及流浸膏為鈕曉紅教授經(jīng)驗(yàn)方，臨床治療結(jié)核性創(chuàng)面安全有效[6-7]。但澤及流浸膏為液態(tài)制劑，灌注竇道后，藥液紗條填塞過緊不利于引流，過松則藥液易從竇道流出。前期研究顯示，納米材料載入水溶性藥物時(shí)具有良好的降解緩釋作用，可延長藥物在創(chuàng)面的停留時(shí)間，促進(jìn)瘡面腐肉脫落，納米纖維還能促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖[8]。與此同時(shí)，正常的皮膚組織細(xì)胞必須貼附于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）才能生長與分化，納米材料具有與皮膚基質(zhì)相似的生物學(xué)特性和化學(xué)成分，有利于維持細(xì)胞的壽命，且實(shí)驗(yàn)證明在較長的培養(yǎng)期內(nèi)，納米材料對部分成纖維細(xì)胞增殖有較高的促進(jìn)作用[9]。為此，我們 與南京理工大學(xué)合作研制了澤及流浸膏納米材料，臨床觀察其能夠促進(jìn)結(jié)核性創(chuàng)面的愈合。本研究觀察經(jīng)澤及流浸膏納米材料干預(yù)后結(jié)核性創(chuàng)面巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，探究創(chuàng)面愈合動態(tài)過程，并與凡士林紗布做療效對比觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2019年3月至9月南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科病房確診為淋巴結(jié)核并出現(xiàn)結(jié)核性創(chuàng)面的患者61例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組31例和對照組30例。治療組男14例，女17例；平均年齡（37.04±12.38）歲；病程≤6個(gè)月18例，6～12個(gè)月7例，＞12個(gè)月6例；局部病灶≤3 cm者13例，＞3 cm者18例；切開引流15例，已破潰16例。對照組男14例，女16例；平均年齡（34.67±11.04）歲；病程≤6個(gè)月19例，6～12個(gè)月8例，＞12個(gè)月3例；局部病灶≤3 cm者14例，＞3 cm者16例；切開引流13例，已破潰17例。2組患者性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會審查，批件號：201807001。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 淋巴結(jié)核伴結(jié)核性創(chuàng)面西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《臨床診療指南：外科學(xué)分冊》[4]87：啞鈴型膿腫反復(fù)破潰流膿，創(chuàng)面經(jīng)久不愈；病理確定為結(jié)核，創(chuàng)面組織或膿液做實(shí)時(shí)熒光PCR-結(jié)核分枝桿菌rpoB基因檢測為陽性。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[10]中瘰疬病陰虛火旺證診斷標(biāo)準(zhǔn)。主證：膿腫潰破，瘡面肉芽疏松、色蒼白或黯紅，可有潛行性空腔，竇道迂曲復(fù)雜，流出清稀膿液，夾有敗絮樣物或豆渣樣物，瘡周皮色紫黯或黯紅。次證：潮熱盜汗，舌紅少苔，脈細(xì)數(shù)。主證必備，結(jié)合次證，即可診斷。1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；創(chuàng)面面積1～18 cm2，竇道長度1～18 cm；年齡18～65歲；患者自愿參加本研究并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 非結(jié)核性創(chuàng)面者；對本研究用藥過敏者；合并其他機(jī)能系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；肌酐（CRE）＞1×N（N為正常值上限），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）＞2×N（N為正常值上限）；精神性疾病患者或孕產(chǎn)婦。

2 治療方法

2.1 基礎(chǔ)治療 予異煙肼（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：T18F009）每次0.3 g，每日1次，口服；利福平（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1812291），每次0.45 g，每日1次，晨起空腹頓服；鹽酸乙胺丁醇（上海新亞藥業(yè)閔行有限公司，批號：063180753），每次0.75 g，每日1次，口服；雙環(huán)醇（北京協(xié)和藥廠，批號：180606），每次25 mg，每日3次，口服。

2.2 治療組 予基礎(chǔ)治療聯(lián)合澤及流浸膏納米材料外用。消毒皮膚、清創(chuàng)去除病灶內(nèi)壞死組織及膿性分泌物，根據(jù)創(chuàng)面深度和寬度剪裁澤及流浸膏納米材料，填塞進(jìn)創(chuàng)腔內(nèi)，松緊適宜，醫(yī)用紗布或醫(yī)用棉墊外覆，醫(yī)用膠布固定，每2 d換藥1次。

澤及流浸膏由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供，制備方法：取澤漆、白及、貓爪草按8.33∶1.00∶1.67 劑量配比，水煎濃縮至流浸膏劑型，每毫升含生藥4.37 g。納米材料的主要成分為殼聚糖和纖維素，此二者也是常用于創(chuàng)面敷料的材料，安全無毒[11]。室溫下將殼聚糖溶解于2%的醋酸溶液中，得到濃度為1%的殼聚糖醋酸溶液。磁力攪拌殼聚糖醋酸溶液并緩慢滴加濃度為4%的氫氧化鈉溶液至殼聚糖完全析出，最終得到均一的殼聚糖凝膠沉淀的懸濁液。將懸濁液離心洗滌得到純凈的殼聚糖凝膠沉淀，置于冰箱保存。于凝膠沉淀中加入提純的澤及流浸膏（殼聚糖凝膠沉淀與澤及流浸膏質(zhì)量比為10∶1）后混合均勻，纖維素經(jīng)羧甲基化后得到羧甲基纖維素，最后按比例加入氧化羧甲基纖維素和甘油，冷凍24 h后再凍干2 d，得到最終的澤及流浸膏納米材料（由南京理工大學(xué)材料學(xué)院制備）。

2.3 對照組 予基礎(chǔ)治療聯(lián)合醫(yī)用凡士林油紗布外用。消毒清創(chuàng)等方法同治療組，予醫(yī)用凡士林油紗布（新鄉(xiāng)市華西衛(wèi)材有限公司，6 cm×20 cm，批號：1933007）填塞創(chuàng)腔，每2 d換藥1次。

2組療程均為28 d。

3 療效觀察

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 創(chuàng)面及皮膚組織巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 于換藥第1、15、28日在創(chuàng)面及邊緣皮膚同一位置取得大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織，務(wù)必做到“快，準(zhǔn)，小，冷”，取材后置于標(biāo)記序號的裝有4%戊二醛溶液的離心管中，冰箱冷藏室固定4 h以上。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，脫水，包埋，最后超薄切片后置于透射電鏡（型號：JEM-1010，南京醫(yī)科大學(xué)電鏡分析測試中心）下觀察巨噬細(xì)胞情況。

3.1.2 創(chuàng)面寬度、深度 于換藥第1、28日行彩超檢查，記錄膿腔上下徑、左右徑、前后徑的測量值。

3.1.3 安全性觀察及復(fù)發(fā)情況 于換藥第1、28日抽取2 組患者靜脈血，查血常規(guī)、肝腎功能主要指標(biāo)。治療結(jié)束后隨訪6 個(gè)月，統(tǒng)計(jì)2 組痊愈患者的復(fù)發(fā)情況。

3.2 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[12]擬定療效判定標(biāo)準(zhǔn)，于療程結(jié)束后判定療效。臨床痊愈：全身癥狀消失，創(chuàng)面愈合，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)正常；顯效：創(chuàng)面縮小1/2以上，或數(shù)量減少1/2以上，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)正常；有效：創(chuàng)面縮小或數(shù)量減少不足1/2，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)有改善；無效：創(chuàng)面大小及數(shù)量無改善。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析，組間療效差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 治療結(jié)果

3.4.1 2組患者臨床療效比較 見表1。

表1 治療組與對照組患者臨床療效比較 單位：例

3.4.2 2組患者創(chuàng)面及皮膚組織巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較 見圖1。換藥第1日：2組患者創(chuàng)面組織巨噬細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征基本一致，鏡下均可見大量線粒體腫脹呈空泡狀，細(xì)胞核崩解為小碎片，核膜消失，提示核碎裂，細(xì)胞內(nèi)高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等結(jié)構(gòu)基本不存在，提示細(xì)胞死亡。換藥第15日：治療組創(chuàng)面組織巨噬細(xì)胞的大量線粒體擴(kuò)張呈空泡狀，相互聚集擠壓，部分線粒體嵴結(jié)構(gòu)存在，可見數(shù)個(gè)髓樣小體，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張呈囊泡狀；對照組創(chuàng)面巨噬細(xì)胞可見大量線粒體無線粒體嵴呈空泡狀，核外形雖存在但核仁消失，可見少量次級溶酶體。換藥第28日：治療組創(chuàng)面巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯生長良好，可觀察到大量結(jié)構(gòu)完整規(guī)則的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，線粒體嵴結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著大量核糖體，可見細(xì)胞膜形態(tài)完整，細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)清晰，核仁形態(tài)正常，溶酶體數(shù)量減少；對照組創(chuàng)面巨噬細(xì)胞仍可見線粒體腫脹溶解，大量呈空泡狀，僅見少量線粒體嵴結(jié)構(gòu)明顯的線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，吞噬小體內(nèi)可見殘余細(xì)胞器。

換藥第1日：2組患者皮膚組織巨噬細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征基本一致，鏡下均可見大量線粒體腫脹呈空泡狀，偶可見線粒體嵴，染色質(zhì)碎片分散在胞核內(nèi)，核膜消失，呈核壞死的表現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜基本不存在。換藥第15日：治療組皮膚組織巨噬細(xì)胞出現(xiàn)較多線粒體，其嵴結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)，相互聚集擠壓，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，可見少量偽足，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見吞噬小體，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；對照組皮膚組織巨噬細(xì)胞僅可見線粒體膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，可見少量高爾基體。2組均可見細(xì)胞周圍皮膚組織特有的膠原纖維。換藥第28日：治療組皮膚組織巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯生長良好，可觀察到大量結(jié)構(gòu)完整規(guī)則的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體嵴結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)清晰，核仁形態(tài)正常，核體積無增大，核內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，細(xì)胞膜形態(tài)完整，偽足清晰可見；對照組皮膚組織巨噬細(xì)胞可見線粒體腫脹溶解，大量呈空泡狀，僅見少量線粒體嵴結(jié)構(gòu)明顯的線粒體，細(xì)胞膜部分溶解，核體積略增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，吞噬小體內(nèi)可見殘余細(xì)胞器。2組均可見細(xì)胞周圍皮膚組織特有的膠原纖維。

3.4.3 2組患者治療前后創(chuàng)面寬度、深度比較 見表2。

3.5 安全性觀察及隨訪復(fù)發(fā)情況 2組患者治療前后血常規(guī)及肝腎功能指標(biāo)均在正常值范圍。隨訪6個(gè)月，治療組痊愈病例創(chuàng)腔愈合好，無全身不適，無復(fù)發(fā)，對照組有1例復(fù)發(fā)。

4 討論

結(jié)核性創(chuàng)面最常見于淋巴結(jié)核中后期寒性膿腫破潰，其特點(diǎn)是長期流膿難愈。根據(jù)淋巴結(jié)核診療指南，在用抗結(jié)核藥物基礎(chǔ)治療的同時(shí)對寒性膿腫可采取切開引流術(shù)或竇道切除術(shù)，但手術(shù)存在病灶清除不徹底，術(shù)中損傷神經(jīng)、血管或淋巴管，術(shù)后創(chuàng)面難愈等風(fēng)險(xiǎn)[13-14]，因此如何提高結(jié)核性創(chuàng)面的療效仍是亟待解決的難題。淋巴結(jié)核屬于中醫(yī)學(xué)“瘰疬”范疇，其核心病機(jī)是毒、瘀、腐、虛。毒為標(biāo)，素體本虛染毒而發(fā)病，毒邪瘀滯，為生腐之源，瘀腐積熱，日久傷陰，故成瘰疬病陰虛火旺之證。瘀腐纏綿，新肉不生，損耗逾甚。毒、瘀、腐、虛四者互為因果，循環(huán)往復(fù)，使瘡面難以向愈。治療當(dāng)以解毒祛瘀、化腐生肌為大法，我們采用澤及流浸膏納米材料直接作用于瘡面起到祛腐拔毒、提膿斂瘡、生肌收口的作用。

圖1 換藥各時(shí)期治療組與對照組創(chuàng)面組織、皮膚組織巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（醋酸鈾、檸檬酸鉛染色法）

表2 治療組與對照組患者治療前后創(chuàng)面各徑測量值比較（） 單位：mm

表2 治療組與對照組患者治療前后創(chuàng)面各徑測量值比較（） 單位：mm

注： 與本組治療前相同徑比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后相同徑比較，##P＜0.01。

組別 例數(shù) 治療前 治療后上下徑 左右徑 前后徑 上下徑 左右徑 前后徑治療組 31 27.77±7.23 22.84±6.01 29.90±8.93 7.97±3.93**## 5.07±3.79**## 5.36±3.92**##對照組 30 24.37±9.46 25.10±7.40 25.20±10.22 19.17±7.44* 18.00±5.69** 19.53±8.22*

明·鄺璠《便民圖纂》云：“男婦瘰疬，貓兒眼睛草一二捆……乃搽此膏，數(shù)次愈?！敝赋鲐垉貉劬Σ荩礉善幔┩庥民ю忒徝鏀?shù)次可愈。明·李時(shí)珍《本草綱目》記載：白及主治“發(fā)背瘰疬……生肌止痛”。澤漆殺蟲消腫、化痰祛瘀，貓爪草解毒祛腐、化痰散結(jié)，白及收斂消腫、生肌止痛。澤漆與貓爪草味辛，能散能行，有散結(jié)行瘀之效，可將瘡面的瘀腐拔除；澤漆與白及性微寒、味苦，滋陰降火；白及與貓爪草味甘，能補(bǔ)虛生新?，F(xiàn)代研究也表明這三種草藥具有良好的抗結(jié)核作用[15-17]。

MTB是一種可寄生于宿主巨噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)病原體，巨噬細(xì)胞可以通過不同的方式消除MTB，因此在結(jié)核性創(chuàng)面治療過程中起到關(guān)鍵的作用。結(jié)核性創(chuàng)面液化壞死高峰期時(shí)，創(chuàng)腔內(nèi)存在大量壞死組織，清除這些組織不僅是去除了創(chuàng)面收縮的障礙，同時(shí)也去除了內(nèi)含的MTB以及其他削弱宿主免疫力的物質(zhì)，因此清除壞死組織對結(jié)核性創(chuàng)面的愈合至關(guān)重要。澤及流浸膏納米材料的優(yōu)勢在于祛腐以促肌生，并可以調(diào)控和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，吸收滲液，在瘡面創(chuàng)造相對潔凈的微環(huán)境，有利肉芽、皮膚的生長。

透射電鏡結(jié)果表明，治療初始時(shí)2組患者創(chuàng)面和皮膚組織巨噬細(xì)胞可見大量線粒體腫脹呈空泡狀，各大細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂不可辨。換藥15 d，2組患者創(chuàng)面和皮膚組織巨噬細(xì)胞均可見溶酶體樣結(jié)構(gòu)而治療組明顯多于對照組。換藥28 d，治療組的各大細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)。說明澤及流浸膏納米材料能改善因結(jié)核桿菌入侵而導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重度擴(kuò)張狀態(tài)，重建核仁。值得關(guān)注的是，本研究觀察到巨噬細(xì)胞超微病理恢復(fù)正常與彩超測得的膿腔上下、左右、前后徑的縮小呈正相關(guān)，即隨著巨噬細(xì)胞的細(xì)胞器改善，創(chuàng)面膿腔也隨之愈合，且治療組的愈合程度遠(yuǎn)大于對照組。

綜上，澤及流浸膏納米材料外用治療結(jié)核性創(chuàng)面效果明顯優(yōu)于醫(yī)用凡士林紗布，并對創(chuàng)面和皮膚組織巨噬細(xì)胞有明顯的修復(fù)作用，安全有效。澤及流浸膏納米材料使中藥行瘀祛腐、解毒生肌的功效通過納米材料的緩釋及降解作用得以充分發(fā)揮，明顯促進(jìn)了結(jié)核性創(chuàng)面愈合，值得臨床推廣，并擬進(jìn)行藥效學(xué)及分子生物學(xué)方面的深入研究。